ENZIMI EPATICI E NON....QUESTI
SCONOSCIUTI.
da appunti personali del dott. Claudio Italiano
Prima di leggere questa pagina, che stranamente non gira per il web, dovete sapere che un medico ma, prima ancora, il paziente stesso deve saper interpretare il risultato delle sue analisi e conoscere che cosa sia un amilasi che sale, una troponina che si impenna, una fosfatasi alcalina elevata, che poi vuol dire che il fegato va male e la bile non scarica!! Se leggerete con attenzione questa pagina, ne saprete di belle! Parola mia! La natura vivente è sede di trasformazioni chimiche; le reazioni chimiche possono avvenire lentamente o si possono accelerare con sostanze come alcali, acidi, ma ciò è possibile in vitro; in natura esistono, invece, gli Enzimi che sono dei biocatalizzatori delle reazioni biochimiche, i quali anche ai valori di pH e temperatura corporea riescono ad aumentare la velocità delle reazioni che avvengono nei tessuti, che altrimenti decorrerebbero in modo troppo lento per essere compatibili con la vita. Inoltre l’energia necessaria per la reazione è ridotta: per es. per scindere il perossido d’idrogeneo H2O2 sono necessarie 2000 Calorie contro 18000 per mole senza catalisi.
Classificazione.
Una classificazione internazionale li classica in 6 gruppi: ossidoreduttasi, transferasi, idrolasi, liasi, isomerasi, ligasi.
Struttura. Sono sostanze di natura proteica che però per espletare la loro funzione richiedono la presenza nella loro struttura di fattori non proteici, dotati di alta specificità; la parte proteica è detta apoenzima, l’altra gruppo prostetico, che non si dissocia dall’enzima, che vale per molte proteine coniugate ed indica una componente non aminoacidica che legata alla proteina conferisce una particolare specificità; ad esempio l’emoglobina il cui eme che lega l’ossigeno rappresenta il gruppo prostetico. Altri enzimi hanno bisogno di coenzimi che si liberano una volta catalizzata la reazione e si rigenerano e che hanno ben precise funzioni derivando dalle vitamine e partecipando direttamente al processo della catalisi, per cui insieme alla parte proteica (detta apoenzima) formano l’oloenzima.
Il piridossalfosfato, che chimicamente differisce poco dalla vitamina B6 (piridossina) è il coenzima per un gruppo di enzimi che vanno sotto il nome di transaminasi. Questi enzimi trasferiscono gli alfa amino gruppi da un amino acido ad un cheto-acido; la tiamina (vit.B1) coenzima delle cocarbossilasi e transchetolasi; le deidrogenasi che hanno come coenzima il nicotinamide-adenin-dinucleotide, (NAD+) o il suo fosfoderivato (NADP+), il primo interviene nelle reazioni cataboliche, il secondo coenzima in reazioni anaboliche.
Il termine di cofattore, invece, è un termine generico che indica piccole molecole organiche che sono essenziali per mantenere la funzione enzimatica, per esempio i fosfolipidi per la betaidrossibutirrato deidrogenasi o il Cl- per l’amilasi, in assenza del quale l’amilasi ha un’attività molto bassa. L’anidrasi carbonica appartiene alla classe dei metallo-enzimi perchè ha un grammo di Zn per mole.
Distribuzione. Alcuni enzimi sono specifici per il regno vegetale, altri per quello animale e nell’ambito di un organismo alcuni si localizzano esclusivamente per es, come il pepsinogeno, nel succo gastrico, altri come l’amilasi si trova nella saliva e nel pancreas, quindi ubiquitario. Nella cellula gli enzimi sono distribuiti negli organuli cellulari, alcuni nel nucleo. altri nel mitocondrio o nel citoplasma; con tecniche di shock meccanico ed osmotico è possibile liberare frazioni subcellulari (tecnica del frazionamento cellulare), quindi con l’ultracentrifugazione differenziale in soluzioni di diversa densità è possibile ottenere la separazione. Gli enzimi del nucleo sono deputati al mantenimento del rinnovamento del materiale genetico del nucleo; gli enzimi mitocondriali catalizzano le reazioni ossidative che producono energia (fosforilazione ossidativa, glicolisi aerobia), la glicolisi anaerobia avviene nel citoplasma. Gli enzimi hanno una specificità stereochimica e si possono avere forme levo e destrogire, specificità di gruppo, di reazione.
Origine e sintesi . Esiste una sintesi proteica che si avvale del RNA messaggero e di 20 RNAt transfert, ciascuno per i diversi 20 aminoacidi che costituiscono le proteine, contro i 200 aminoacidi che conosciamo in natura. La sintesi è sotto il controllo di un gene regolatore e un gene strutturale; nella cellula alcuni gene restano inespressi; es. se l’E.coli vive in un ambiente dove c’è glucoso anzichè galattoso, non produrrà la Beta galattosidasi perchè la sua sintesi è repressa; c’è un gene regolatore che attiva un gene repressore che agisce sul gene operatore; questo è il fenomeno della induzione enzimatica o adattamento: nel ratto con carenza di molibdeno non produce xantina ossidasi;
Meccanismo d’azione dell’enzima. L’enzima causa un abbassamento dell’energia d’attivazione ed un n° inferiore di molecole può così interagire e con inferiore energia. Un enzima è specifico perchè agisce solo su un determinato substrato e spesso si fissa a determinate strutture, per es. mitocondriali.Velocità di reazione, essa è importante per l’equilibrio stesso della reazione che deve avvenire rapidamente negli esseri viventi. Nella reazione enzimatica, per studiarla, consideriamo la concentrazione dell’enzima, del substrato, la temperatura ed il pH; nella reazione non tutto il substrato è saturato; col substrato aumentiamo la saturazione dell’enzima; anche la temperatura ci può influenzare una reazione enzimatica; per es. l’ATPasi mitocondriale viene inattivato a 5° C di temperatura, per cui esiste una stabilità dell’enzima che è funzione della temperatura; l’attività dell’enzima è correlata anche al pH, dato che la catena proteica di cui è composta l’enzima contiene dei gruppi che possono ionizzarsi diversamente dal pH. Come le proteine anche gli enzimi hanno un punto isoelettrico, cioè hanno un pH a cui la loro carica netta è uguale a zero. Di solito il pH del punto isoelettrico non coincide con quello di massima attività; es. la pepsina agisce a PH 1,5 nello stomaco, l’arginasi a pH 9,7, comunque il valore di pH oscilla tra 4-8; per cui i siti attivi dell’enzima possono inattivarsi in presenza di un valore di pH che si allontani dall’optimum.
Meccanismi della catalisi enzimatica. Gli enzimi hanno dimensioni più grandi rispetto a quelle del substrato; i siti attivi possono essere inattivati o inibiti da sostanze : si parla di inattivazione se la reazione è irreversibile, inibizione se se sostanze si possono rimuovere. L’inibizione si dice competitiva quando il substrato è spostato dalle sostanze inibenti; cioè la sostanza che inibisce compete col substrato, ma se aumenta la quantità di substrato, questo può competere per il sito attivo e rimuove la sostanza inibente; inibizione non competitiva quando il substrato si lega nel suo sito e le sostanze inibitorie si fissano altrove ma , per es, per cariche elettriche, impediscono che la reazione avvenga; per cui essi possono legarsi: 1) al sito attivo in modo irreversibile, 2) in altra sede , 3) in due o più punti di cui uno del sito attivo.
Analizzando il meccanismo della catalisi, avremo:
E+S= ES=ES*->EP->E+P
dove E è l’enzima libero che interagisce col substrato S per formare il complesso ES, ES* è il complesso attivato, EP è il complesso fra l’enzima ed il prodotto e P è il prodotto finale libero. Quando E si lega ad S abbiamo dei centri o siti attivi, residui aminoacidici laterali, quindi forze di attrazione e siti in cui l’enzima esplica la sua capacità catalitica; cìè una specificità stereochimica e sono almeno tre o più i punti di attacco, che si caratterizzano per forze di attrazione o forze di Van der Wals, cioè per gruppi carichi, come quelli degli zuccheri, dei legami idrogeno, c’è una sorta di contatto come di una chiave nella serratura; come avviene ciò? il substrato ha dei legami, supponiamo del legame peptidico C-O, ebbene l’enzima determina una torsione del legame ed il substrato diventa reattivo.
Parte clinica della Enzimologia.
Se l’attività vitale è caratterizzata dalle reazioni enzimatiche, la deviazione da tale ordinato sistema di reazioni genera malattia; ciò è dovuto alla azione di noxae patogene quali farmaci, agenti infettivi, veleni, radiazioni, ustioni, carcinoma, patologie genetiche che causano enzimopatie. Le manifestazioni sono molto variabili e poco visibili. Nelle enzimopatie si producono vie metaboliche alternative così come anche nelle epatiti virali vi sono sovvertimenti cellulari. Uno studio delle reazioni enzimatiche in vitro è possibile grazie agli omogenati, tuttavia questi preparati non danno la situazione reale che sussiste in vivo manca l’influsso neuro-ormonale. Se vogliamo conoscere le attività enzimatiche otteniamo il rilievo degli enzimi nel sangue e nei liquidi biologici perchè sappiamo che difficilmente vi sono attività enzimatiche nel sangue eccezion fatta per la trombina, la plasmina, ecc. della coagulazione o la tripsina; altrimenti se c’è lesione come nell’IMA, epatite c’è rialzo enzimatico. Queste attività enzimatiche nel sangue hanno valori bassi, perchè ci sono fenomeni che sono quelli di inattivazione, inibizione, eliminazione; quando cìè lesione, invece, la fuoriuscita di enzimi dipende dalla differenza di gradiente di concentrazione tra interno ed esterno cellulare, oppure dal fatto che se l’enzima è presente nel citoplasma fuoriesce prima, se è presente nel mitocondrio è più difficile.
Alterazioni enzimatiche acute da danno tissutale: 1) per aumento della permeabilità cellulare (es. da sforzo tissutale nello sport), se dosiamo le aldolasi o ALD o le fosfocreatinkinasi o CPK esse risultano aumentate, quindi d.d. con IMA, dove CKMB è più specifico; 2) ipossia tessutale per occlusione delle coronarie, il miocardio non ha glicogeno a sufficienza e va incontro a necrosi per occlusione da ipossia acuta, per cui ne deriva un rialzo di CPK, CKMB (specifico), LDH, GOT e GPT. Nella patologia da ipossia da tetracloruro di carbonio o da amanita phalloides a livello epatico si determina una lesione con rialzo prima di GPT (si trova nel citoplasma) e poi di GOT che si trova nel mitocondrio, poi si distruggono i lisosomi e si rialza yGT.
Alterazioni enzimatiche croniche da lesioni croniche del fegato dove si arriva al massimo a 400 U/L per necrosi tissutale e lisi; nella cirrosi talora non trovate aumento delle transaminasi perchè c’è una riduzione della produzione delle proteine enzimatiche ed i valori sono nei limiti. Altre volte è espressione dell’attività fibroblastica con aumento di enzimi specifici, come gli isoenzimi della F.A., la ALP4 mentre il rialzo degli enzimi delle vie biliari in corso di ostruzione è modesto: questi enzimi sono: la GOT e GPT, yGT, FA, la 5 nucleotidasi e la leucinoaminopeptidasi; nella lesione del polmone c’è aumento della LDH e nelle patologie renali alfaglucosidasi e betaglucosidasi; l’aumento dell’ALD e nelle distrofie miogene di tipo Duchenne, le distruzioni neurogene hanno incrementi minori; nelle pancreatiti: rialzo delle amilasi e della lipasi che è più specifica e più tardiva. Poi abbiamo alterazioni enzimatiche da aumentata o ridotta sintesi. Il fegato quando c’è patologia epatica si riducono le proteine enzimatiche, fra gli enzimi la colinesterasi, l’arilesterasi, la ceruloplasmina, la protrombina. La CHE è un markers per la evoluzione della cirrosi epatica, una volta si valutava la shunt-porta cava; la CHE idrolizza le sostanze curaro-simili. I soggetti possono essere eterozigoti per la codifica dell’enzima atipico ed il soggetto deve essere testato perchè se omozigote per l’enzima atipico muore dopo l’impiego in anestesia di curaro. Altro grosso capitolo è quello delle enzimopatia là dove l’organismo ha una minore produzione o assenza; vengono allora attivate vie alternative, vedi fenilchetonuria; l’enzimopatia si evidenzia col deficit enzimatico: si è visto che questi enzimi sono presenti negli epatociti.
Caso con incremento della produzione di enzimi; la FA è prodotta dagli osteoblasti e si incrementa nel sarcoma osteogenico, osteite deformante, nel rachitismo, nel malassorbimento intestinale, tubulopatie renali, iperparatiroidismo. Nel tessuto epatico, nelle patologie con colestasi abbiamo due teorie per spiegare: 1) teoria ritentiva della FA: è prodotta dal tessuto osseo che lo riversa nel sangue ed il fegato non può esplicare la eliminazione, però è una vecchia teoria abbandonata; 2) teoria epatogenica: è presente per occlusione VB, se si danno inibitori della sintesi enzimatica, allora all’incremento dell’ostruzione si determina un incremento della sintesi; l’ostruzione è stimolo alla sintesi di produzione di questi enzimi epatici e canalicolari.Secondo questa teoria c’è un aumento della 5nucleotidasi e la leucinoaminopeptidasi, la yGT; nell’epatite alcolica c’è un aumento della yGT; altri enzimi sono la fosfatasi acida prostatica che si incrementa nelle metastasi del t. osseo; qui ciò avviene per produzione di FA da parte dei osteoclasti e la fostatasi alcalina dagli osteoblasti (?), nell’anemia megaloblastica si ha aumento dell’LDH perchè il midollo aumenta la sintesi. Lo stesso dicasi nelle broncopolmoniti, nelle anemie emolitiche aumento pure l’LDH.
Parliamo degli Isoenzimi; una volta scoperti si è visto che gli enzimi non avevano lo stesso Ph, punto isoelettrico, resistenza fisica, contenuto proteico, glucidico, contenuto in acido sialico. L’enzima nella sua totalità, es. la LDH è ubiquitario per cui il suo incremento nel siero non ci dice nulla di particolare; dobbiamo allora dosare gli isoenzimi. I metodi di analisi si dividono in generali e selettivi. Metodi generali di analisi: per mobilità elettroforetica (migrano secondo le bande alfa1, alfa2, beta, gammaglobuline); poi abbiamo anche metodiche cromatografiche a scambio ionico, su supporto di destrano o selfadex, oppure separazione per punto isoelettrico. Metodi selettivi: chimici, fisici, immunologici; chimici--> sfruttano sostanze inibitrice, es. la dibucaina per la colinesterasi, le isochinasi il triptofano. Fisici--> resistenza al calore; quelli immunologici -->si impiegano anticorpi specifici e si saggia successivamente l’attività enzimatica residua. Gli isoenzimi si possono differenziare nella loro struttura quaternaria; la LDH è data da 4 subunità polipetidiche; gli isoenzimi si differenzieranno perciò nella struttura fondamentale, per l’azione enzimatica, per il contenuto in materiale proteico e non proteico. La LDH esiste come 5 subtipi di isoenzimi, LDH1-2-3-4-5, quindi è un tetramero; LDH1 è nel cervello, nel Globulo rosso; la 4 e 5 nel fegato, muscolo scheletrico; LDH4 però è anche ubiquitaria. La LDH1 contiene 4 subunità A, la LDH5 ->4 subunità B; la 2-> 3 subunità A ed 1 B; la 3--> 2 subunità A e 2 subunità B; la 4 contiene 1 subunità A e 3B; A seconda della patologia avremo una specificità dell’isoenzima: LDH1 è nel muscolo cardiaco, mentre LDH4 e 5 è riscontrabile nelle patologie epatiche; per quanto concerne la mobilità elettroforetica migra con le Alb, alfa1 ed alfa2, beta e gamma, quindi anche dotato di diversa mobilità elettroforetica. Gli altri isoenzimi sono quelli della F.A.--> n° 4 isoenzimi: ALP1, ALP2, ALP3, ALP4; essi si differenziano per diversa mobilità elettroforetica di Alfa1, alfa2, beta e gamma rispettivamente. Noi riscontriamo la ALP2 nel soggetto normale con due bande ossea ed epatica che si separano la prima come banda stretta, la seconda più larga su gel di poliacrilamide, mentre su supporto di agarcellulosa la banda sarà unica: la fosfatasi alcalina è infatti ossea ed epatica. La ALP3 è di origine intestinale ma ha diversa percentuale che va dal 2% e secondo altri al 50%, a seconda che si tratti di soggetti secretori o non secretori; anche il pasto grasso può influire nella aumento di ALP3; la F.A.nella fisiologia, per es., risulta aumentata nell’adolescente con accrescimento osseo oppure nelle patologie ossee; la ALP3 compare in gravidanza ed è prodotta dalla placenta e si differenzia perchè resiste a 65°C per 3 ore. La ALP3 compare in corso di tumori, antigene di Reagan, viene prodotta per attivazione genica embrionale; ALP4 e ALP5 si incrementano nelle epatopatie; ALP1 e ALP4 nelle forme ostruttive, ALP4 nella cirrosi epatica e sono espressione dell’attività dei fibroblasti.La CPK o PhosfoCreatinKinasi si distingue per 2 dimeri: la subunità B, brain ed M, muscule; la F.A. per contenuto in acido sialico. LA CPK BB -> si trova nel cervello nel 96% e poi nella muscolatura liscia intestinale; il CPK MB si riscontra nel 40% nel cuore e per il 60% nel muscolo scheletrico ed il CPK MM per il 90% nel muscolo scheletrico. Il CPK MB -> IMA; nelle patologie muscolari il CPK MM; nell’Infarto intestinale aumenta il CPKMB. Altri isoenzimi la amilasi: 2 isoenzimi : 60% salivare e 40% pancreatica; un aumento dell’amilasi si avrà nella pancreatite acuta; un incremento della amilasi salivare può aversi nelle patologie polmonari, polmoniti, patologie ovariche. L’amilasi supera di norma il filtro renale: un incremento dei suoi valori si può avere nella insufficienza renale; talora invece aumenta l’amilasemia ma l’amilasuria è nella norma: esempio nella macroamilasemia con amilasi di peso molecolare elevato: qui però non si deve trattare. lo stesso dicasi per la fosfatasi acida che esiste in forme diverse, alcune di peso 16.000 e le riscontriamo nei g.r., poi dimeri fra 100 mila e 120 mila, nel fegato e milaza, leucociti e piastrine. La F.A. prostatica ha peso molecolare di 2000 e si riscontra aumentata nelle metastasi ossee. La colinesterasi: si divide in Acetilcolinesterasi e pseudocolinesterasi, la prima si trova nel SNC e la pseudocolinesterasi nel fegato e nel plasma ed ha affinità per gli esteri della colina; esistono 11 isoenzimi della pseudocolinesterasi ed 2 per la acetilesterasi. Gli enzimi nelle patologie epatiche li dobbiamo dividere in a) enzimi espressione dell’attività parenchimale enzimatica e b) enzimi della citolisi. A) Espressione dell’attività parenchimale del fegato --> Pseudocolinesterasi che valuta l’andamento di una cirrosi al pari dell’Albumina, della protombina; nel corso di epatite virale acuta si ha riduzione della CHE in 15 gg perchè l’emivita dell’enzima è tale.La pseudocolinesterasi si riduce per altre patologie: malnutrizione, mesenchimopatie diffuse. B) enzimi della citolisi-->GOT, GPT, glutamato deifrogenasi, isocitricodeidrogenasi, latticodeidrogenasi, ornitilcarbamiltransferasi, guanasi, xantino ossidasi, glucosio 6 fosfatasi. La guanasi aumenta nel precoma dell’epatite virale acuta precocemente e la fosfoesosoisomerasi aumenta nelle lesioni metastatiche epatiche. Transaminasi--> p.q.r. la GPT è citoplasmatica ma si può avere anche nel mitocondrio (nell’IMA aumenta la GOT); la GOT si divide in GOT 2 che è mitocondriale e GOT 1 citoplasmatica; La GPT, perciò, essendo citoplasmatica è maggiore nell’epatite virale acuta rispetto a GOT, per necrosi dell’epatocita (1000-2000 unità; per cui il rapporto GOT/GPT si sposta a favore della GPT e si ha inversione; se, invece, l’epatopatia ha impronta colestatica come anche nell’epatite tossica da funghi o da amanita falloides o Cl4C si incrementa la quota di GOT per danno mitocondriale. Nell’epatite virale la GPT aumenta di più anche perchè le GOT sono più facilmente inattivate nel circolo; i valori sono fino a 3-8 la norma; le GOT si incrementano di più perchè c’è sofferenza mitocondriale, lo stesso per le epatiti reattive aspecifiche o per litiasi del coledoco. Le epatiti reattivi aspecifiche si hanno nel tifo e nella salmonellosi; nelle epatiti anitteriche hanno importanza per rivelare il danno epatico; nelle neoplasie metastatiche la GOT è più modesta, la Glutammico deidrogenasi si trova nel fegato e si comporta come la GOT di tipo 2 e si incrementa nelle epatopatie croniche e nelle colestasi (perchè c’è sofferenza parenchimale mitocondriale) mentre < incremento si ha nelle cirrosi; poi abbiamo l’ornitil carbamil transferasi che aumenta nelle patologie epatitiche acute virali o tssoiche: si innalza precocemente e torna alla norma prima delle transaminasi. Più modesto è l’incremento per cirrosi, neoplasie metastatiche. La isocitricodeidrogenasi aumenta per epatite virale acuta, quindi la ornitil carbamiltransferasi nella necrosi parenchimale acuta. La malicodeidrogenasi è ubiquitaria ed aumenta nelle anemie emolitiche e perniciose e nelle epatopatie; in particolare la malico 1 e 2: epatiti virali acute e colestasi. La Latticodeidrogenasi è ubiquitaria; nell’IMA e nello shock si incrementa; la LDH5 nell’epatite virale acuta e la LDH4 negli itteri ostruttivi. Poi abbiamo la aldolasi, sia epatica che muscolare. La fruttosio 1-6 difosfatasi epatica si incrementa nell’epatite virale ma anche nell’IMA. La sorbitolodeidrogenasi si incrementa nelle epatiti virali acute e poi nella colestasi; Nella Stasi la F.A. si incrementa nella patologia ossea ed epatica, negli itteri ostruttivi ed è prodotta dalla membrana del polo vascolare dell’epatocita e dai canalicoli biliari. L’ostruzione è stimolo alla sua produzione, non si riversa (teoria del rigurgito), ma si stimola (teoria dell’induzione) ALP1. Poi abbiamo la leucinoaminopeptidasi LAP, con 3 forme isoenzimatiche: 1) si incrementa in gravidanza, 2) epatopatie, 3) itteri ostruttivi con ostruzioni extraepatiche; poi la 5 nucleotidasi prodotta dai canalicoli con incremento nell’ostruzione non per patologie ossee. La gamma glutamiltranspeptidasi che si incrementa nell’etilismo cronico, nella cirrosi alcolica, nelle neoplasie del fegato; il 1° segno predittivo è dato da un incremento della yGT (forma 1 e 2); nella cirrosi biliare primitiva può comparire la yGT3 ed anche nelle forme metastatiche; il rapporto gamma 1/2 diventa > di 2 mentre nella cirrosi biliare si abbassa; l’ultimo enzima è la lecitina colesterolo acil transferasi; si riduce nelle condizioni di sofferenza cronica del fegato.