Protocolli di laboratorio
Estrazione del DNA dal sangue periferico. Protocollo segnalato da A. Bonizzato (Centro FC di Verona).

Procedura:

In un tubo da 15 ml mescolare 4 ml di sangue (evitare l’uso dell’eparina come anticoagulante) con 4 ml di soluzione RCB, quindi lasciare in agitazione per 10 minuti.

Centrifugare per 10 minuti a 875 g. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 4 ml di soluzione RCB, lasciare in agitazione per 10 minuti.

Centrifugare per 10 minuti a 875 g. Scartare completamente il supernatante e risospendere il pellet in 0.85 ml di soluzione WCB. Se il campione di sangue è particolarmente vecchio o coagulato, aggiungere 0.05 ml di Proteinase K [preparata risospendendo 6000 U in 10 ml di Tris-HCl (pH8.5) 20mM].

Incubare 30 minuti a 55°C vortexando ogni tanto i tubi. Al termine la soluzione dovrà essere omogenea e priva di aggregati.

Trasferire il tutto in una provetta da 1.5 ml. Aggiungere 0.365 ml di NaCl 5M. Mescolare brevemente e centrifugare 10 minuti a 14000 g.

Nel frattempo, preparare dei tubi da 15 ml contenenti 2.5 ml di etanolo assoluto. Al termine della centrifugazione precedente, trasferire il supernatante nel tubo con l'etanolo e mescolare invertendo la provetta fino alla formazione della medusa.

Spostare la medusa con una pasteur pulita sulla parete del tubo, aspirare l'etanolo e usando etanolo 70% risciacquare la medusa.

Spostare nuovamente la medusa sulla parete del tubo, aspirare l'etanolo e lasciare asciugare per circa 10 minuti.

Al termine, aggiungere 0.5-1 ml di buffer TE e risospendere con grande cura.

Il protocollo può essere adattato a volumi diversi di sangue mantenendo inalterate le proporzioni con i vari reagenti e utilizzando provette di dimensioni adeguate. Se il volume iniziale non è sufficiente non si avrà la formazione della medusa e di conseguenza sarà necessario recuperare il DNA centrifugando per 15 minuti a 14000 g. Utilizzando volumi maggiori di sangue è utile aumentare i tempi delle incubazioni e delle centrifugazioni.

Preparazione delle soluzioni:

Red cell buffer (RCB)

	Conc. iniziale		Conc. finale
Tris-HCl (7.6)	1 M	5 ml	10 mM
KCl	1 M	5 ml	10 mM
MgCl2	1 M	5 ml	10 mM
EDTA (pH8)	0.5 M	2 ml	2 mM

Portare a 500 ml aggiungendo acqua distillata, filtrare per sterilizzare.

Aggiungere 12.5 ml di Nonidet P40 (eventualmente sostituire con Igepal).

White cell buffer (WCB)

	Conc. iniziale		Conc. finale
Tris-HCl (7.6)	1 M	0.5 ml	10 mM
KCl	1 M	0.5 ml	10 mM
MgCl2	1 M	0.5 ml	10 mM
EDTA	0.5 M	0.2 ml	2 mM
NaCl	5 M	4 ml	400 mM

Portare a 50 ml aggiungendo acqua distillata, filtrare per sterilizzare.

Aggiungere 3.125 ml di SDS 10% (per sciogliere portare a 37°C).

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988 Feb 11;16(3):1215.