Verbale riunione del
Sottogruppo “Laboratori di Genetica Molecolare”
del Gruppo Italiano Fibrosi
Cistica (GIFC)
Orvieto 27 Novembre 2001
Baffico .M. A.O. Galliera – Genova
Baldinotti F. A.O. Santa Chiara – Pisa
Bartolozzi M., Rossi M. A.O. Della Misericordia – Grosseto
Bonizzato A. Centro Regionale FC – Verona
Bossi A. Università di Biometria e Statistica di Milano
Castaldo G. CEINGE Dip. Biotecnologie – Napoli
Castellani C. Centro Regionale FC - Verona
Lucarelli M. Policlinico Umberto I – Roma
Pignatti P.F., Bombieri C. Università di Verona
Restagno G. A.O. U.I.R.M. San Anna –Torino
Rosatelli C. Università di Cagliari
Sangiuolo F. Università di Tor Vergata – Roma
Santostasi T., Polizzi L. Policlinico di Bari
Seia M, Coviello D. Ist. Clinici di Perfezionamento – Milano
Assenti:
Amoruso A., Morgutti M. IRCCS Burlo Garofalo – Trieste
Di Girgenti C. A.O. G. Di Cristina – Palermo
Ferrari M. IRCCS San Raffaele – Milano
Giovanucci Uzielli M.L. A.O. Meyer – Firenze
Ravani A. A.O. San Anna – Ferrara
Scarpa M., Picci L. Centro Malattie Rare – Padova
ARGOMENTI E TEMATICHE
discusse al sottogruppo:
1. “pianificazione organizzativa degli iter diagnostici nelle diverse tipologie di indagine”
2. “Classificazione delle varianti nel gene CFTR “.
La discussione del punto 1 è stata fatta in base alla raccolta dei dati estrapolati dai questionari compilati da tutti i laboratori italiani ( E-mail: 26.11.2001).
Da una prima analisi dei dati emerge che per alcune tipologie di indagine la strategia italiana è abbastanza omogenea e gli iter diagnostici prescelti dai diversi laboratori differiscono a secondo della motivazione della richiesta e risultano in linea generale, tranne poche eccezioni, sovrapponibili in senso informativo. L’unico centro che si diversifica dagli altri è quello del dott. Picci di Padova dove viene attuato un unico protocollo di indagine approfondito indipendentemente dalla tipologia della richiesta.
Dall’analisi delle diverse tipologie di indagine sono emersi protocolli di studio finalizzati al rispetto della qualità dell’analisi e al rapporto costo-beneficio.
In particolare sono stati proposti ed accettati dal Sottogruppo i seguenti protocolli operativi:
Pazienti affetti: pannello di base e successivo screening degli esoni di tutto il gene CFTR.
I laboratori di Cagliari ( Prof. Rosatelli C.), Firenze ( dott.ssa Torricelli F.) e Napoli ( Prof. Castaldo G.) hanno dato la loro disponibilità ad eseguire analisi in service per approfondimento degli esoni con tecnica DGGE o DHPLC. E’ emersa la raccomandazione ai colleghi clinici di offrire tale esame prima alle coppie in età riproduttiva in modo da arrivare ad una eventuale diagnosi prenatale con analisi di fattibilità già eseguita.
Non si sono concordate modalità comuni relative all’espletamento delle pratiche amministrative che, per il momento verranno stabilite dal laboratorio che accetta l’analisi.
E’ comunque auspicabile l’attuazione di una procedura amministrativa comune a tutti i Centri in modo da raggiungere una sovrapposizione uniforme. Finalizzato a questo scopo troverete un allegato comprendente una tabella con le tariffe del SSN , compilate le diverse voci a secondo delle vostre procedure interne (es. noi tariffiamo le OLA moltiplicando la tariffa relativa alla tecnica RDB X 2) rispeditemi i dati e cercheremo di formulare una proposta di tariffario comune per tutti i laboratori.
Familiarità: ricerca delle mutazioni specifiche presenti nella famiglia in esame. In caso di zii e cugini indipendentemente dal grado di parentela non è sufficiente ricercare solo la mutazione familiare ma è stato approvato uno studio basato sulla ricerca di un pannello di mutazioni (OLA, Innolipa, RDB).
In caso di assenza di mutazioni familiari note alcuni laboratori (Prof. Castaldo e dott.ssa Santostasi )eseguono analisi di linkage per l’identificazione del carrier.
Partner di eterozigoti: ricerca di un pannello di mutazioni e approfondimento mediante studio di mutazioni specifiche della regione di origine. A tale proposito, in attesa della rielaborazione della mappa delle mutazioni da parte del Prof. Piazza, vi è stata la proposta della Prof. Rosatelli di notificare a tutti i componenti del sottogruppo le frequenze regionali delle mutazioni delle proprie casistiche. La proposta è stata accettata dall’assemblea e pertanto ogni laboratorio dovrà inviare alla dott.ssa Gabriella Restagno, che si è dichiarata disponibile, i dati delle frequenze regionali. Gabriella ha proposto di fare una tabella in Excel che verrà poi messa a disposizione di tutti i componenti del sottogruppo.
La scelta di non approfondire l’analisi, in questa tipologia di soggetti, con DGGE o DHPLC ha motivazioni basate sull’ottenimento di un rapporto costo beneficio accettabile ed anche in considerazione che l’identificazione di eventuali varianti provocherebbe solo ansia e indurrebbe un aumento della richiesta di DPN non giustificabile.
Problematica
associata all’uso di Kit commerciali :
alcuni laboratori eseguono la ricerca delle mutazioni utilizzando il KIT Innolipa che permette anche la valutazione dei PolyT ; questo dato fornito alle donne di soggetti carrier candidate alla fecondazione assistita può generare l’induzione di diagnosi preimpianto o di DPN ( donne che presentano l’allele 5T), in quanto i ginecologi, normalmente non a conoscenza della problematica, associano il 5T alle mutazioni che causano CF. Quindi, in linea al principio che il laboratorio deve identificare le mutazioni che causano CF e non selezionare la sterilità maschile, nel caso di indagini molecolari richieste per fecondazione assistita nelle partner di eterozigoti sarebbe preferibile non fornire l’analisi dei poly T.
DPN: ricerca di mutazioni specifiche eventuali, VNTR per contaminazione materna, correlazione familiare.
In caso di richiesta di DPN con esame di fattibilità parziale (assenza di 1 o entrambi le mutazioni) il Prof. Castaldo ha dato la disponibilità ad eseguire DPN mediante analisi di linkage con microsatelliti intragenici.
Iperecogenicità delle anse intestinali: ricerca di un pannello di mutazioni e screening degli esoni che codicano le porzioni NBF ed R domain della proteina per la ricerca di mutazioni severe associate a quadri clinici di ileo da meconio.
In caso di positività di uno dei due coniugi estendere l’analisi a tutto il gene? A tale proposito l’assemblea non ha raggiunto una linea comune, pertanto resto in attesa di commenti per stabilire una linea comune.
Il Prof. Castaldo propone di concordare e scrivere in collaborazione con i ginecologi un documento informativo comune allo scopo di selezionare i casi di iperecogenicità da inviare al laboratorio.
La dott.ssa Torricelli propone, invece, di progettare la stesura di documenti a carattere regionale in cui il centro clinico in collaborazione con il laboratorio promuove la formazione di ginecologici da sensibilizzare e istruire alla problematica per la selezione delle richieste. La proposta della dott.ssa Torriccelli è stata accettata dall’assemblea.
Pazienti sospetti - CF-Like - Sterilità maschile: E’ emersa la necessità di una stretta collaborazione con i Centri clinici specifici. L’indagine molecolare dovrebbe essere articolata in due fasi: I fase ricerca di un pannello di base e valutazione dei PolyT in caso di test negativo può essere possibile eseguire una riconsiderazione clinica del paziente, e nel caso in cui la sintomatologia deponga per un forte sospetto di CF, estendere l’analisi a tutto il gene CFTR.
Il Prof. Pignatti ha proposto di effettuare una distinzione nella strategia di indagine nei soggetti con CBAVD o CUAVD e azoospermia. In particolare nei pazienti CBAVD ( e assenza di problematiche renali) s’identificano quasi sempre due mutazioni. In questo caso la strategia proposta è stata quella di eseguire un indagine basata sullo screening di tutti gli esoni . Scopo: corretta genotipizzazione e mirata consulenza genetica con corretto calcolo del rischio residuo riproduttivo.
Il dott. Castellani osserva che in questi 3 gruppi di quadri clinici è importante identificare tutte le mutazioni severe/ mild o le varianti e l’analisi genetica è di fondamentale importanza per:
- Inquadramento diagnostico di pazienti che non hanno diagnosi clinica
- prognosi (CBAVD con due mutazioni nel gene CFTR è diverso da 5T/5T)
- consulenza genetica
Secondo dati riportati dal congresso di Orlando (Ottobre 2001) la proposta è di identificare come forme PRE CF le forme oggi conosciute come sospette .
Consulenza genetica: riveste una fondamentale importanza in tutte le coppie con un rischio residuo. Nel caso di pazienti sterili eterozigoti e partner negativa con all’indagine del DNA è necessario predisporre una consulenza mirata considerando sia il rischio di circa 1/400 di concepire un figlio CF sia notificare alla coppia il rischio di circa 1/400 di concepire un figlio affetto da una possibile forma atipica.
Calcolo del rischio residuo: è emerso che vi sono delle problematiche per la sua applicazione in alcune categorie a rischio. A tale proposito stiamo cercando di organizzare per il prossimo anno (Aprile – Maggio) un seminario dedicato a chiarire le basi statistiche e le applicazioni in CF. Probabilmente sarà coinvolto il dott. Maurizio Clementi dell’Università di Padova. Vi comunicherò appena avrò notizie più dettagliate la data e il luogo dell’incontro.
Referto: Vi è stata una proposta formulata dalla Prof. Rosatelli di elaborare una tipologia comune di refertazione.
Il referto dovrebbe prevedere le seguenti voci:
· Intestazione del laboratorio
· Nome Cognome
· Data di nascita
· N° identificativo (N° di registro)
· Provenienza del campione (Reparto, Centro, Medico richiedente)
· Indicazione all’analisi
· Materiale pervenuto (sangue, CVS o LA)
· Materiale analizzato
· Tecnica utilizzata
· Sensibilità del test nella popolazione in esame
· Formulazione diagnosi ( qualora sia possibile :eterozigote, affetto)
· Formulazione del rischio residuo
· Segnalazione dell’invio alla consulenza genetica
La dott. Restagno ha sollevato il problema che, durante un visita ispettiva ISO 9001 presso il suo laboratorio, è stata invitata ad inserire nei suoi referti anche la data di esecuzione del test. Il particolare è sembrato eccessivo e si è concluso che il suo inserimento può essere considerato facoltativo.
Il referto deve essere specifico per ogni singolo individuo anche nel caso che sia una coppia a sottoporsi all’analisi per la tutela della privacy. In questo caso è opportuno allegare un’ulteriore referto con la spiegazione del rischio residuo di coppia. La stesura di quest’ultimo deve essere chiara e comprensibile anche per i non operatori.
Analisi a pagamento di coppie candidate alla fecondazione assistita per sterilità femminile e coppie della popolazione non a rischio di CF: la prof. Rosatelli si sta interessando a risolvere tale problematica e svilupperà un documento per la sua applicazione uniforme in tutte le regioni.
2) Varianti del gene CFTR:
Relazione della dott. Bombieri: sono stati riportatati i dati di uno studio multicentrico (Italia centrale e nord orientale, Francia, Repubblica Ceca) eseguito sulla popolazione normale allo scopo di identificare il maggior numero possibile di varianti certamente “non CF-causing ” (l’identificazione si basa, per ognuna di esse, sul fatto di mostrare una frequenza certamente superiore alla frequenza globale delle mutazioni “CF causing” non ancora identificate). A questo scopo hanno studiato tutti i 27 esoni e regioni fiancheggianti del gene CF su campioni dell’ordine di 2000-2500 geni random. I dati sono in corso di pubblicazione.
All’interno del gruppo di lavoro “Implicazione clinica delle mutazioni: raccolta dati, creazione di un data base delle mutazioni e/o polimorfismi riscontrate nei laboratori italiani”
vi sono state due proposte:
Registro - dott. Coviello: proposta di creare un registro online di tutti i soggetti che sono sottoposti ad analisi molecolare del gene CFTR. Tale registro sarebbe costituito da una sola pagina con 9 voci da compilare. In caso di laboratori senza connessione diretta si potrebbe prevedere la compilazione su dischetto. Per i centri che hanno già i dati in un sistema computerizzato si potrebbe chiedere ai tecnici il trasferimenti diretto, per quelli che non hanno un registro computerizzato, potrebbe essere una occasione per crearlo. Il vantaggio di costituire un registro dei laboratori potrebbe essere:
1) Avere una visione in tempo reale delle mutazioni e/o polimorfismi individuati nei laboratori del gruppo di lavoro
2) Poter elaborare i dati (con una gestione diretta) per avere informazioni sulla frequenza e sulla regione di origine di mutazioni/polimorfismi.
3) Questo sarebbe un registro in grado di fornire un’immagine completa delle variazioni genomiche del gene CFTR, in quanto includerebbe categorie non presenti nel registro clinico CF. Infatti verrebbero inclusi tutti i soggetti con un riscontro di variabilità: non affetti (sterili idiopatici), o non affetti dalla forma tipica (per es. CBAVD) o sebbene affetti, solo in modo lieve e quindi non seguiti dai centri pediatrici che hanno creato il registro Italiano CF. Inoltre incrociando i dati del registro del gene CFTR con quelli del registro pazienti CF potrebbe servire per verificare quanto sia rappresentativo il registro nazionale clinico. L’impressione è che molti dati sfuggano al registro clinico.
Dopo una breve discussione la maggioranza ritiene troppo laborioso creare tale registro e la proposta viene accantonata.
Data Base – dott. Bonizzato: proposta di fare un database online (simile al modello del Consorzio ma focalizzato alla realtà genetica italiana) di facile e rapida consultazione allo scopo di dare l’opportunità a tutti gli operatori interessati di ottenere eventuali informazioni di mutazioni/varianti il cui significato non è chiaro. Il data base potrebbe essere impostato con una pagina di apertura comprendente l’elenco delle mutazioni/varianti identificate. Da ogni singola mutazione sarà possibile accedere alla pagina dedicata contenente tutte le informazioni specifiche quali: frequenza, correlazioni genotipo/fenotipo e dati della letteratura. La differenza con la proposta precedente del registro è che ogni laboratorio dovrebbe mettere nel data base il numero complessivo di soggetti esaminati ed il numero dei soggetti che hanno una determinata mutazione/polimorfismo con il fenotipo (se presente) comune al gruppo di soggetti, senza introdurre la scheda di tutti i singoli soggetti.
L’organizzazione e la realizzazione del data base dovrebbe prevedere l’invio dei dati ed informazioni da elaborare e inserire nel database al gruppo di lavoro Bonizzato, Coviello, Picci, già costituito nella scorsa riunione, ma aperto a chi volesse contribuire. Questo progetto anche se ancora da definire nei dettagli e non di immediata e facile realizzazione potrebbe diventare un ottimo strumento di aiuto per tutti gli operatori.
Alla domanda di quale server usare per ospitare il registro o il data base, Coviello risponde che probabilmente la SIGU potrebbe ospitare tale iniziativa e la Dott.ssa Taruscio offre la disponibilità del server presso il suo istituto (ISS) dove esiste un gruppo di informatici che potrebbe contribuire alla creazione del data base.
Rielaborazione mappa delle mutazioni: presentazione della Prof. Bossi relativa alla tipizzazione genetica dei pazienti CF inseriti nel Registro Nazionale. In accordo con il Prof. Piazza si era pensato che i dati genetici inseriti nel Registro potessero fornire la casistica per la rielaborazione della mappa delle mutazioni.
Nel registro italiano sono inseriti 4193 pazienti di cui 585 non sono mai stati sottoposti ad analisi genetica e 152 sono deceduti. Dei 3456 CF sottoposti ad analisi genetica in 2040 si sono identificate due mutazioni , in 1086 pazienti si è identificata una sola mutazione, in 250 non si è identificata nessuna mutazione e mancano i risultati genetici relativi ad 80 pazienti.
E’ stata chiesta a tutti i partecipanti la disponibilità di fornire in collaborazione con i Centri clinici :
- attribuzione delle mancanti provincie di nascita dei nonni
- Segnalazione,in ogni singolo caso in cui non sia stata identificata la mutazione, della tecnica utilizzata per la ricerca delle mutazioni.
La rielaborazione della mappa delle mutazioni richiederà successivamente un approfondimento, qualora possibile, dell’analisi genetica nei casi di mutazioni sconosciute. Dalla riunione è emerso che vi sono delle realtà in cui manca l’interazione tra laboratorio e centro clinico regionale di riferimento. I centri clinici hanno già ricevuto i listati dei pazienti mandati dalla Prof. Bossi e alcuni hanno già fornito tutte le indicazioni, altri dovrebbero mettersi in contatto con i laboratori, se ciò non accadesse il laboratorio dovrà sollecitare il Responsabile del centro. Abbiamo scelto di inviare i listati ai Centri e non ai laboratori perché l’invio dei dati al Registro è di competenza clinica.
Il lavoro da eseguire non è di facile attuazione ma sarà di sicura utilità in senso informativo.
Il prof. Pignatti ha offerto la disponibilità a partecipare al prossimo incontro con il Prof. Piazza che avverrà , dopo aver visionato i dati completi raccolti dal Registro, per scegliere la migliore strategia da seguire.
Il Prof. Pignatti suggerisce anche di prendere in considerazione il mutamento della demografia Italiana, prendendo in considerazione, anche altre etnie (popolazione di origine albanese ecc..) ed eventualmente estrapolare almeno 100 pazienti per ogni regione nel caso in cui il lavoro, richiesto ai laboratori relativo all’approfondimento dei dati del Registro, risultasse troppo gravoso.
Progetto nazionale per la standardizzazione e l’assicurazione di qualità dei test genetici: Relazione della dott.ssa Taruscio. Sono stato presentati i dati in generale positivi e riportati alcuni commenti dei gruppi presenti alla riunione di Roma: servirebbe una maggire uniformità nella stesura del referto; la mutazione G1244E non viene ricercata in diversi laboratori, nelle regioni in cui tale mutazione è presente con una frequenza non trascurabile l’esame molecolare dovrebbe includere anche questa. Il progetto è finanziato anche per il 2002, e quindi ci sarà un altro giro di controlli di qualità in cui si perfezioneranno le modalità di trasmissione dei dati, ma per gli anni successivi bisognerà chiedere che il progetto venga nuovamente finanziato. Tutti sono favorevoli al controllo nazionale anche se si sovrappone con quello Europeo, in quanto rispecchia di più la realtà genetica nazionale. (Prego la dott.ssa Taruscio di integrare liberamente questa parte di verbale)