Graziella Borgo 1, Faustina Lalatta 2, Angelo Cantù-Rajnoldi 2, Carlo Castellani 1, Maurizio Ferrari3, Anna Maria Giunta 4, Luciana Iapichino 5, Marco Lucci 6, Maurizio Scarpa 7
1) Centro Fibrosi
Cistica-Ospedale Civile Maggiore,Verona
2) Dipartimento di
Medicina di Laboratorio-Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano
3) Laboratorio Analisi
Cliniche -Ospedale S. Raffaele, Milano
4) Centro Fibrosi
Cistica- Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano
5) Centro Fibrosi
Cistica - Ospedale dei Bambini G. De
Cristina, Palermo
6) Servizio di
Genetica Medica - Ospedale S. Anna, Ferrara
7) Dipartimento di Pediatria,
Università di Padova
Sono oggi disponibili tecniche di genetica molecolare per
la diagnosi sia di portatore sia di malato di fibrosi cistica (FC), ma non vi è
ancora a livello internazionale e nazionale un orientamento certo e diffuso su
chi, come, quando, debba o possa utilizzarle (1-3).
Scopo di queste linee-guida è fornire un inquadramento
del problema e proporre una pratica corretta di informazione e utilizzo del
test genetico per fibrosi cistica oggi in Italia.
Esse sono destinate ai medici e a tutti gli operatori sanitari che negli
ospedali, nei laboratori, negli ambulatori o consultori, sono coinvolti sul
tema della fibrosi cistica e sono chiamati ad eseguire il test e a comunicare
sullo stesso con gli utenti.
Il documento è stato elaborato dalla Commissione Genetica del Gruppo di
Studio Fibrosi Cistica della Società Italiana di Pediatria.
Fibrosi Cistica: storia naturale della
malattia, prognosi, terapie.
La fibrosi cistica (FC) è malattia genetica
trasmessa con meccanismo autosomico recessivo, correlata alla anomalia della proteina CFTR (Cystic
Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), presente nella membrana apicale
delle cellule epiteliali dove svolge una funzione di regolazione degli scambi
idroelettrolitici (4). Il gene codificante per tale proteina si trova sul
braccio lungo del cromosoma 7 (5,6).
La proteina alterata determina un difetto nel
trasporto del cloro e conseguentemente presenza di secrezioni poco idratate a
livello delle cellule epiteliali presenti nei vari apparati dell'organismo. Si
hanno così l'accumulo di muco nei bronchi, l'ispessimento del succo pancreatico
e i caratteristici elevati livelli di cloro nel sudore. Altri organi
tipicamente interessati sono il fegato, l'intestino, l'apparato riproduttivo (Tab 1). Le funzioni
intellettive e cognitive sono del tutto normali. Caratteristica della malattia
è che le modalità di comparsa, l'entità dei sintomi e il decorso sono
estremamente variabili. Alcuni malati possono presentare precocemente gli
aspetti polmonari della malattia (infezioni respiratorie ricorrenti) e le
manifestazioni gastrointestinali quali l'ileo da meconio alla nascita e la sindrome da malassorbimento secondaria
all’insufficienza pancreatica; altri hanno sintomi respiratori modesti e
contenuti fino all'adolescenza (tosse saltuaria, sinusite, poliposi nasale),
con quadro digestivo normale; per altri ancora i sintomi predominanti sono
quelli dell'epatopatia o del diabete. In età adulta vengono oggi diagnosticate
forme di malattia che hanno come manifestazione quasi esclusivamente l'infertilità
maschile dovuta all'assenza congenita dei dotti deferenti (7-9) oppure, in entrambi i sessi, episodi di pancreatite
ricorrente (10).
La prognosi è determinata dall'entità della
broncopneumopatia che è, nella maggior parte dei casi, evolutiva ed ingravescente;
è però influenzata anche dallo stato di nutrizione, migliore nei soggetti
diagnosticati precocemente (11), come pure dall'aderenza al programma di cure e
alla presa in carico assistenziale da parte di centri specializzati (12). Il
trattamento della pneumopatia consiste principalmente in fisioterapia
respiratoria e antibioticoterapia intensiva. Per l’insufficienza pancreatica,
enzimi pancreatici, supporto di vitamine liposolubili e alimentazione
ipercalorica. Per le complicanze polmonari (pneumotorace, emottisi) e digestive
(ipertensione portale, occlusioni intestinali) sono previsti protocolli di
intervento chirurgico o medico intensivo. Sono in fase di studio farmaci mirati
al miglioramento del trasporto ionico (13-15). Sta aumentando, con risultati
soddisfacenti, l'esperienza del trapianto di polmone nelle situazioni di
insufficienza respiratoria irreversibile (16) e più raramente, in casi
selezionati di insufficienza epatica,
quella del trapianto di fegato. E' allo studio, in una fase molto preliminare,
la realizzabilità della terapia genica del difetto di base (17).
Il Registro Nazionale per Fibrosi Cistica (18),
attivato in Italia nel 1988, indica che i malati in vita al 31/12/97 sono 3222,
dei quali i1 45% ha più di 18 anni, il 10% circa più di 30 anni (da 31 a 65).
Ogni anno vengono fatte oltre 150 nuove
diagnosi e l'età mediana alla diagnosi è di circa 9 mesi. L'aspettativa di vita rimane poco prevedibile individualmente; mediamente è ridotta rispetto a quella della
popolazione generale, ma va progressivamente aumentando: sempre dai dati del
Registro Nazionale emerge che nei primi anni 80 il 50% dei malati non superava
i 14 anni, mentre nel '97 la stessa quota supera i 20 anni, con qualità di vita
soddisfacente tranne che negli stadi di acutizzazione o terminali della malattia.
Epidemiologia e genetica
La FC
è la malattia ereditaria grave più comune nella popolazione caucasica, con una
incidenza di 1 neonato malato ogni 2500-3500 nati vivi. La frequenza
dell'eterozigote FC è perciò compresa tra 1:25 e 1:30. In altre popolazioni
(Africani, Asiatici) l'incidenza risulta minore (3). Va tenuto presente che i lavori pubblicati in
campo epidemiologico si riferiscono a realtà disomogenee e difficilmente
confrontabili (19); per l'Italia è disponibile qualche raro studio
popolazionistico (20) che stima la frequenza del portatore essere simile a
quelle sopraddette: per esempio, nel Veneto in base al numero dei soggetti
diagnosticati malati attraverso screening neonatale (21), la frequenza del portatore
è valutata essere 1:27. E' possibile che nella rilevazione epidemiologica vi
sia una sottostima per diagnosi mancate di forme particolarmente lievi o
atipiche.
A
carico del gene CFTR, localizzato nel 1989 sul braccio lungo del cromosoma 7 e
identificato come specifico gene-malattia, sono riportate finora oltre 900
mutazioni (22). Esse interessano principalmente una o poche basi nucleotidiche
e sono distribuite per lo più nella parte esonica del gene e nelle sequenze di
giunzione tra esoni e introni, più raramente negli introni. La frequenza delle
mutazioni è diversa nelle varie nazioni e anche nelle regioni di una singola
nazione, data la diversa origine delle popolazioni che vi si sono insediate. La
mutazione DeltaF508 (delezione di 3 paia di basi codificanti per l'aminoacido
fenilalanina al codone 508) è diffusa in tutto il mondo ed è quella presente
nel maggior numero di cromosomi FC. La sua frequenza nel Sud Europa è più bassa
rispetto al Nord Europa (23); in Italia una indagine multicentrica (24), che ha
esaminato la frequenza di 12 mutazioni principali nel genotipo dei malati della
maggior parte delle regioni, ha mostrato che DeltaF508 è di gran lunga la più
frequente ma che la sua frequenza, così come quella delle altre mutazioni
indagate, è assai variabile a seconda delle regioni. Nel loro insieme 12
mutazioni caratterizzano il 73% dei cromosomi FC italiani: ma rappresentano
complessivamente solo il 63-64% di quelli diffusi nella popolazione della
Calabria e del Lazio, invece l'84-85% di quelli della popolazione della
Sardegna e del Trentino (Tab.2).
Correlazione genotipo-fenotipo
L'identificazione
delle specifiche mutazioni non è predittiva della severità della malattia
polmonare (25-27). In questo ambito si suppone l'intervento, accanto al gene
CFTR, di geni modificatori e di fattori ambientali (28). Una correlazione
genotipo-fenotipo è documentata solo per alcune mutazioni e lo stato di
sufficienza o insufficienza pancreatica (29,30).
E'
oggi conosciuta la frequente presenza di una o, più raramente, due mutazioni FC
nel genotipo di soggetti adulti con infertilità secondaria ad assenza congenita
dei dotti deferenti (7-9), come pure in maschi e femmine, in età anche
avanzata, con storia di pancreatiti recidivanti (10) o broncopneumopatia
bronchiectasica (31). In questi casi l'interpretazione del risultato fornito
dall'analisi del genotipo è assai complessa ed è opportuno che sia demandata ad
una consulenza genetica specialistica, dato che per distinguere la condizione
di portatore da quella di malato si rendono necessarie una valutazione clinica
mirata e la conoscenza approfondita di un'area diagnostica problematica.
Tecniche utilizzate per l'analisi genetica in fibrosi
cistica
Attualmente
i laboratori di biologia molecolare hanno a disposizione numerose tecniche per
la ricerca delle mutazioni del gene CFTR. Esse si dividono essenzialmente in
due gruppi: quelle utilizzate per la ricerca di mutazioni frequenti e note e quelle utilizzate per la
ricerca di mutazioni rare o non ancora conosciute (Tab.3). Le prime
(Analisi Eteroduplex, Digestione con Enzimi di Restrizione, Amplification Refractory
Mutation System, Reverse Dot Blot, ecc) (32) hanno costi relativamente elevati
e non eccessiva complessità di esecuzione; si prestano ad indagare la presenza
di una serie, di mutazioni, per ora abbastanza limitata, in un ampio numero di
individui. Queste tecniche sono alla base di alcuni kit diagnostici (33) creati
e commercializzati a questo scopo; che però hanno il limite di una sensibilità
ancora non verificata nella popolazione italiana (si conoscono risultati
relativi solo ad uno di essi, sperimentato su di una popolazione di neonati
piemontesi, lombardi e pugliesi) (34) e comunque variabile da regione a
regione, data la diversa frequenza delle mutazioni sul territorio nazionale.
Le
tecniche che raggiungono sensibilità elevata (Singol Strand Conformational
Polymorphism, Denaturant Gradient Gel Electrophoresis, Denaturing
High-Performance Liquid Chromatography, Sequenziamento) (35) sono in grado di
identificare un numero elevatissimo di mutazioni, tra cui quelle rare o
addirittura non ancora conosciute: queste tecniche hanno costi elevati, sono
sofisticate e richiedono tempi più lunghi.
Un
censimento dell'utilizzo in Italia delle tecniche di genetica molecolare per
fibrosi cistica e un elenco dei laboratori che le eseguono è disponibile sul
sito Internet della Società Italiana di Genetica Umana:
htpp:\\sigu.uniroma2.it.
Screening Genetico
Si
definisce screening genetico l'analisi di un'ampia popolazione con l'intento di
individuare soggetti malati o portatori di una malattia ereditaria. L'OMS ha
stabilito (36) che perchè sia messo in atto uno screening di popolazione per un
certo tratto genetico devono sussistere delle condizioni preliminari. Le
principali di esse sono: gravità e rilevante prevalenza della malattia in
oggetto; disponibilità di un test per il portatore altamente sensibile,
specifico ed economico; strutture adeguate (consultori e centri per la diagnosi
prenatale) per la campagna educativa ed operativa che è indispensabile supporto
al test. La fibrosi cistica, malattia autosomica recessiva con alta frequenza
di portatori, può rispondere alla prima condizione, ma la sua eterogeneità
allelica rende difficile realizzare sul piano tecnico un test utilizzabile a livello
di massa. Esso dovrebbe infatti essere in grado di diagnosticare almeno il 95%
dei portatori: solo con questa soglia le coppie in cui uno dei due risulta
portatore e l'altro negativo al test vengono ad avere un rischio di figlio
affetto da FC simile a quello delle coppie che non hanno fatto il test (37) (Tab.4).
Inoltre
l'ampiezza della popolazione a cui il test sarebbe destinato fa apparire
insufficienti, anche nelle nazioni fornite di apparati sanitari efficienti, le
strutture consultoriali al momento disponibili. Per queste ragioni autorevoli
organizzazioni scientifiche
nord-americane hanno ritenuto in passato improponibile lo screening FC
della popolazione generale (1,2) e suggerito invece programmi di testing
genetico.
Si
intende con tale termine l'analisi genetica rivolta, invece che alla generalità
della popolazione, a gruppi o categorie
di essa. I familiari dei malati FC, soggetti caratterizzati rispetto alla
popolazione generale da una maggiore probabilità di essere portatori del gene,
sono stati ritenuti avere priorità in
tali programmi (38,39).
Nella
popolazione generale sono state condotti studi-pilota allo scopo di saggiare,
in presenza dei limiti tecnici ed organizzativi sopra detti, quale sia
l'accettabilità del testing FC e quale la fascia-target più sensibile (40,42).
La fascia di popolazione rappresentata dalle donne in gravidanza è apparsa
quella più recettiva all'offerta del test (43); modeste invece la conoscenza della
malattia e l'interesse al test da parte di altre categorie di popolazione (44).
Sulla base di queste evidenze il più recente documento di National Institutes
of Health (3) ha ribadito che negli U.S.A lo screening per FC della popolazione
generale non è per ora praticabile; ha piuttosto suggerito che il test genetico
sia offerto a quelle coppie della popolazione generale che pianificano o hanno
avviato una gravidanza e venga eseguito se, dopo una "accurata e
bilanciata" informazione (vedi oltre), esse scelgano di farlo. Questo
orientamento rappresenta una sorta di compromesso rispetto ad un programma di
screening generale ed è modellato sulla complessa realtà americana
(multietnica, multiculturale, dotata parzialmente di un sistema sanitario
pubblico e provvista invece di un vasto mercato assicurativo per la copertura
individuale della spesa per la salute) (45).
La
realtà italiana è caratterizzata dal fatto che un test utilizzabile su scala
nazionale avrebbe una modesta sensibilità (mediamente più bassa di quella
possibile nella popolazione bianca degli U.S.A) e lontana dalla soglia critica
del 95% ritenuta necessaria per un programma di screening. Ogni regione
italiana dovrebbe quindi definire la frequenza relativa delle più comuni
mutazioni nella propria popolazione e con questo dato verificare l'attuabilità
di un test che si avvicini il più possibile a tale soglia. Sulla scorta di
quanto emerso fino ad oggi le regioni in cui questo potrebbe realizzarsi sono
pochissime (46), e in ogni caso ogni regione, nell'ambito delle strutture
pubbliche, dovrebbe operare una propria scelta di strategia sanitaria, alla
luce di un ragionevole bilancio costi-benefici (47-51). Anche per quanto
riguarda le strutture consultoriali di supporto all'erogazione del test va
registrata una estrema variabilità delle risorse disponibili sul territorio
nazionale e comunque mediamente un livello del tutto insufficiente rispetto
alle esigenze preventivabili; infine appare estremamente bassa, in assenza di
adeguate campagne educative, la conoscenza della malattia.
L'alternativa praticabile è la diffusione di un programma
di testing genetico nei soggetti che hanno probabilità aumentata, rispetto alla
popolazione generale, di essere portatori del gene FC o rischio aumentato di
avere la malattia FC.
In accordo con questo criterio sono proposte le seguenti
linee-guida: esse delineano le indicazioni all'uso del test per la diagnosi di
portatore (in soggetti adulti) e la diagnosi di malattia (a livello prenatale,
neonatale, età pediatrica, adulti). Per ogni indicazione vengono descritti gli
aspetti fondamentali inerenti la fattibilità del test e le informazioni che
devono accompagnarne l'offerta.
Indipendentemente
dall'indicazione, valgono per il test genetico FC i principi, validi per tutti
i test diagnostici basati su tecniche
di genetica molecolare, espressi anche dall'Istituto Superiore di Sanità in un
apposito documento (52 ): il laboratorio che esegue il test deve essere
inserito in programmi di certificazione di qualità (53); l'esecuzione del test
va preceduta dall'informazione e dalla decisione autonoma e consapevole
dell'individuo di sottoporsi al test (consenso informato, vedi allegato); nei
minori il test dovrebbe essere evitato, ad eccezione di particolari situazioni
per le quali si dimostri la sua utilità in termini medici, psicosociali o
riproduttivi; il risultato del test è strettamente personale e va mantenuto
riservato (per fornirlo ad altre persone occorre il consenso dell'interessato);
il risultato deve essere fornito sotto forma di referto dettagliato e
comprensibile e con il supporto del colloquio di consulenza genetica,
raccomandabile sempre, indispensabile nel caso di soggetti o coppie con
risultato positivo.
1. INDICAZIONI ALL'USO DEL TEST GENETICO FC PER DIAGNOSI
DI PORTATORE
-Individui con storia familiare positiva per fibrosi
cistica
Il
test è indicato per i consanguinei di un soggetto diagnosticato affetto da FC o
portatore FC, informando che la probabilità di essere portatori è tanto più
alta quanto più stretta la parentela (Tab.5). Nei
soggetti consanguinei di un malato o di un portatore la sensibilità del test
diventa notevolmente più elevata rispetto ai soggetti della popolazione
generale se sono note le mutazioni presenti nel malato o la mutazione del
soggetto portatore.
Qualora
il soggetto che si è sottoposto al test risulti portatore è raccomandabile
eseguire il test nel-nella partner per valutare il rischio che la coppia abbia
figli affetti da FC.
E'
indicato eseguire il test anche nel-nella partner di un soggetto malato che
intenda avere figli, dato il rischio aumentato della coppia di avere figli
affetti da FC.
-Coppie di soggetti consanguinei
Dato
il carattere autosomico recessivo della FC, nelle coppie di soggetti con
consanguineità stretta (per esempio coppie di primi cugini) vi è un aumento del
rischio di avere figli affetti da FC.
E'
indicato il test genetico in entrambi i membri della coppia. Al momento
dell'offerta del test essi vanno informati del fatto che la FC non è la sola
malattia autosomica recessiva per cui la consanguineità comporti aumento del
rischio riproduttivo, e che questo ed altri eventuali accertamenti non
diminuiscono particolarmente il rischio complessivo. Nel caso di coppie con
coefficiente di consanguineità inferiore (ad esempio coppie di secondi cugini)
il rischio di avere un figlio affetto da FC è simile a quello della popolazione
generale.
-Coppie con gravidanza con Intestino Iperecogeno Fetale
Nel feto
con iperecogenicità intestinale il rischio di FC (circa 3%) (54,55) è superiore
a quello della popolazione generale (0.04%).
La
diagnosi di intestino iperecogeno presenta peraltro alcuni aspetti
problematici: la mancanza di parametri omogenei per la definizione di
iperecogenicità (56), la possibile transitorietà dell'immagine, l'epoca
avanzata di gravidanza in cui essa viene riscontrata (non prima della 15-16a settimana di gestazione, spesso attorno alla 20a ).In particolare riguardo a quest'ultimo aspetto la
coppia va preliminarmente informata che qualora il risultato finale delle
indagini indichi la presenza di malattia FC nel feto e venga richiesta
l’interruzione della gravidanza, essa può essere praticata nei limiti e con le
modalità previste dalla legge 22.05.78 n.194 art.6-7. Compatibilmente con i
tempi di massima urgenza che devono essere adottati, è indicato eseguire prima
il test per il portatore in entrambi i membri della coppia e poi, in caso di
positività, la diagnosi prenatale per FC. Se per ragioni di tempo si decide di
eseguire l'analisi genetica per FC direttamente sul feto, è importante indagare
contemporaneamente i genitori: è l'insieme di questi risultati che permette di
definire il rischio di FC nel feto. Al momento dell'offerta del test FC la
coppia deve essere informata anche del rischio di altre patologie possibilmente
associate ad intestino iperecogeno fetale (anomalie cromosomiche, infezioni
congenite) (57) e dell' indicazione quindi ad eseguire altri accertamenti volti
a diagnosticarle.
Nel
neonato che ha presentato in epoca fetale intestino iperecogeno, con
accertamenti prenatali che non hanno potuto escludere il sospetto di fibrosi
cistica, è opportuno follow-up clinico ed esecuzione del test del sudore per
conferma o esclusione di malattia FC.
-Donatori di seme
Al
momento della stesura di queste note sono in discussione alcuni provvedimenti
legislativi in merito alla fecondazione con seme omologo ed eterologo.
Nel
caso di utilizzo di seme omologo per una tecnica di fecondazione assistita, si
veda il paragrafo "Coppie che richiedono tecniche di fecondazione
assistita" e il comportamento che viene suggerito.
In
relazione alla tecnica della inseminazione con seme eterologo, è indicato che
il donatore venga sottoposto al test per il portatore FC analizzando il maggior
numero possibile di mutazioni (58-60).
-Soggetti con Infertilità secondaria ad Assenza Congenita dei Dotti Deferenti
Nei
soggetti con azoospermia secondaria ad Assenza Congenita dei Dotti Deferenti è
stata ampiamente documentata una frequenza aumentata di mutazioni FC. E'
indicato il test genetico sia nel soggetto infertile che nella partner,
informando che il risultato può avere ricadute importanti nei confronti delle
scelte o delle possibilità riproduttive. La presenza nel genotipo del soggetto
infertile anche di una sola mutazione FC rende necessaria una valutazione
clinica mirata e un approfondimento diagnostico per fibrosi cistica (61).
Nelle condizioni fino a qui descritte, vi è indicazione al test genetico FC. Si ricorda che in base alla normativa vigente (Decreto Ministero Sanità 10.9.98. Protocolli di accesso agli esami di laboratorio e di diagnostica strumentale per le donne in stato di gravidanza e a tutela della maternità, articolo 2) "in funzione preconcezionale, sono escluse da partecipazione al costo le prestazioni di laboratorio necessarie per accertare eventuali difetti genetici, prescritte dallo specialista alla coppia, se l'anamnesi riproduttiva o familiare della coppia evidenzia condizioni di rischio per il feto". Tale normativa può creare difficoltà di interpretazione e difformità di comportamenti. La Società Italiana di Genetica Umana ha espresso la necessità di chiarimenti (62).
Nelle condizioni descritte di seguito non vi è
indicazione al test genetico per diagnosi di portatore: si fornisce per esse
una valutazione e si delinea il comportamento attualmente praticabile.
ALTRE FORME DI INFERTILITA' MASCHILE: in letteratura è stato occasionalmente riportato un
aumento di frequenza di mutazioni FC in forme di infertilità maschile non
caratterizzate da azoospermia, ma da alterata qualità del liquido seminale (63)
o da alterazioni morfologiche dell'apparato genitale (es. presenza di vescicole
seminali rudimentali o singole) (64). Si tratta di segnalazioni limitate e
sporadiche, non sufficienti allo stato attuale a porre l'indicazione
all'utilizzo dell' analisi genetica in questi soggetti. Sono necessari
ulteriori studi per chiarire la correlazione fra queste patologie e il gene FC.
COPPIE DELLA POPOLAZIONE GENERALE
Si tratta di coppie nelle quali nessuno
dei componenti ha rapporti di parentela
con malati FC o portatori FC, o è
oggetto di procedimenti diagnostico per sospetta FC, o è compreso in altri
gruppi citati in questo documento. Non esiste per queste coppie un aumento del
rischio di generare figli affetti da FC rispetto alla popolazione generale, e
non vi è pertanto indicazione specifica al test per il portatore FC.
Qualora, nonostante ciò, il test sia
prospettato o venga spontaneamente richiesto, è indispensabile informare
preliminarmente che esso riguarda una
fra le diverse malattie genetiche per
cui il soggetto o la coppia ha un rischio riproduttivo generico e che questo o
altri eventuali accertamenti sono in grado di ridurre solo parzialmente tale
rischio. Va poi fornita l'informazione specifica i cui aspetti salienti (Tab.6) vanno
dettagliati in un documento da illustrare prima dell'esecuzione del test
("informazioni e consenso", vedi allegato). Avendo compreso le
informazioni fornite, il soggetto o la coppia potrà recedere dalla richiesta del test o confermarla. Se la
confermerà il test verrà eseguito.
COPPIE CHE RICHIEDONO TECNICHE DI
FECONDAZIONE ASSISTITA: se la ragione per
cui la coppia chiede l'intervento di un Centro per Fecondazione Assistita è diversa dall'infertilità secondaria ad
Atresia dei Dotti Deferenti, essa non ha un aumento del rischio di generare figli
affetti da fibrosi cistica e non vi è quindi indicazione specifica al test per
il portatore FC. Di fatto va registrato che la richiesta di eseguire il test
per il portatore FC, indipendentemente dall'eziologia dell'infertilità della
coppia, è diventata prassi comune nei Centri per Fecondazione Assistita. In
questi casi l'analisi genetica può essere eseguita seguendo le modalità
applicate alla popolazione generale (vedi sopra).
2. INDICAZIONI ALL'USO DEL TEST GENETICO FC PER DIAGNOSI PRENATALE
-Coppie in cui entrambi i soggetti sono portatori del
gene FC.
Le
coppie costituite da due portatori hanno rischio elevato di avere un figlio FC
(1:4). Vi è per esse indicazione alla diagnosi prenatale FC; per poterla
eseguire è necessaria l'identificazione della
mutazione FC di cui i due soggetti sono portatori. Se un genitore ha un
figlio malato ma è portatore di una mutazione non identificabile, la diagnosi
prenatale può essere realizzabile attraverso altre tecniche (analisi di siti
polimorfici, ovvero di sequenze diverse, ma pur sempre normali, di DNA ereditabili in associazione al gene FC),
purchè sia disponibile il DNA del figlio affetto e dell'altro genitore. L'iter
diagnostico ottimale è rappresentato dallo studio dell'informatività familiare
(identificazione delle mutazioni o dei polimorfismi informativi) seguito dal
prelievo di villi coriali eseguito a partire dalla decima settimana di
gravidanza. L'analisi genetica può essere però eseguita in casi selezionati
anche su sangue fetale e su amniociti. Se la coppia è informativa, il livello
di accuratezza della diagnosi è estremamente elevato. E' indispensabile che la
coppia riceva il (i) colloquio(i) di consulenza genetica e sia raccolto il
consenso alla procedura (vedi allegato).
COPPIE DI PORTATORI E DIAGNOSI
PREIMPIANTO: la diagnosi genetica
preimpianto viene realizzata analizzando gli oociti non ancora fecondati
(diagnosi preconcezionale su corpuscoli polari) oppure i blastomeri degli
oociti già fecondati (con selezione di quelli che risultano affetti). Dopo la
diagnosi si procede all'impianto in utero degli embrioni non affetti.
In Italia la sua fattibilità sotto il
profilo legislativo non è stata ancora definita.
E' procedura di cui non sono ancora
certi i dati inerenti l'accuratezza diagnostica, la sicurezza e la probabilità
di avvio di gravidanza per ogni ciclo diagnostico (65,66). Pertanto è da
considerarsi procedura ancora
sperimentale e la coppia che la richiedesse va preliminarmente informata di questa
aspetto. Appare poco probabile che questo
approccio diagnostico, data la sua attuale elevata complessità tecnica, gli
altissimi costi e i molti problemi
etici correlati, possa avere a breve ampia diffusione.
Nelle condizioni descritte di seguito non vi è
indicazione al test genetico FC per diagnosi prenatale: si fornisce per
esse una valutazione e si suggerisce il comportamento attualmente praticabile.
COPPIE A RISCHIO INTERMEDIO DI FIGLIO
FC
Vengono così definite le coppie
costituite da un soggetto portatore e
l'altro negativo all'analisi genetica.
In relazione alla limitata sensibilità
del test attualmente disponibile nella popolazione italiana, il rischio di
avere un figlio FC è per tale coppia superiore a quello della popolazione
generale, comunque usualmente attorno a un ordine di grandezza di circa 1:400
(vedi Tab.4).
In queste situazioni il partner
negativo all'analisi genetica standard potrebbe teoricamente trarre vantaggio
da altre tecniche di ricerca di mutazioni (DGGE, SSCP, vedi Tab.3), in grado,
se negative, di ricondurre il rischio della coppia al rischio riproduttivo
generale. Tali tecniche, oltre ad avere
tempi lunghi di esecuzione e costi assai elevati, non arrivano ad
escludere totalmente la presenza di mutazioni FC o possono evidenziare
mutazioni il cui effetto fenotipico è sconosciuto o di difficile
interpretazione.
In caso di gravidanza potrebbe essere presa in considerazione la
cosiddetta diagnosi prenatale di esclusione: l'assenza nel DNA fetale della
mutazione del genitore portatore consentirà di escludere l'ipotesi di feto
affetto nel 50% dei casi. Tuttavia nel rimanente 50% dei casi, il feto avrà
ereditato la mutazione del genitore e il rischio di malattia raddoppierà. Un
accertamento ulteriore in epoca avanzata di gravidanza (dosaggio di enzimi
microvillari su liquido amniotico prelevato in 18a settimana di
gravidanza) ha sensibilità e specificità non ottimali e non permette di
arrivare a conclusioni diagnostiche di assoluta certezza (67).
Per queste ragioni si ritiene che la
diagnosi prenatale nella coppie portatore-non portatore sia attualmente
estremamente problematica: la coppia
deve avere informazioni accurate e
ampio sostegno di consulenza genetica per valutarne consapevolmente vantaggi e
svantaggi.
TESTING FETALE IN ACCOMPAGNAMENTO A DIAGNOSI PRENATALE PER ALTRE
INDICAZIONI
Si intende con questa definizione
l'applicazione del test genetico per FC direttamente su materiale fetale
prelevato per altre indicazioni diagnostiche. Questa prassi appare non
condivisibile in quanto si ritiene condizione preliminare la valutazione del
rischio riproduttivo della coppia e l'indicazione alla diagnosi sul feto solo
in caso di rischio elevato; inoltre va tenuto presente che l'identificazione di
una sola mutazione sul materiale fetale non può, con il tipo di indagine correntemente
applicata, distinguere tra feto affetto e feto semplicemente portatore. Per far
ciò sarebbe necessario ricorrere a tecniche diagnostiche più sofisticate,
lunghe, costose (vedi sopra) e spesso comunque non risolutive.
3. INDICAZIONI AL TEST GENETICO FC PER DIAGNOSI DI
MALATTIA:
-in presenza di sospetto clinico
In
presenza di sintomi o dati clinici sospetti per fibrosi cistica (vedi Tab.1) è
indicata l'esecuzione del test genetico. Il test va eseguito dopo adeguata informazione
dell'interessato o dei genitori, se il soggetto è minorenne; non va mai
eseguito come indagine singola e preliminare, ma solo nel contesto dell'iter
diagnostico per fibrosi cistica.
Va tenuto presente che una ricerca delle
mutazioni più comuni, vale a dire l'esecuzione di un test che abbia una
sensibilità intorno al 70%, può diagnosticare un genotipo FC in non più del 50%
degli affetti (questa è la quota di affetti che risulta avere genotipo con due
mutazioni identificabili) (37); inoltre non è in grado di distinguere il
soggetto portatore (presenza di una mutazione) dal soggetto malato che ha due
mutazioni, una sola delle quali identificabile.
Per
questo, per la diagnosi della malattia resta di fondamentale importanza il test
del sudore (68), positivo nella quasi totalità dei casi. Nei casi con valore
dubbio o addirittura negativo (eccezionali ma non impossibili) (69), vanno
eseguite una valutazione clinica mirata e indagini supplementari specifiche
(70) in ambiente specializzato. Qualora venga concluso per la diagnosi di
fibrosi cistica, è fondamentale fornire, oltre all'indirizzo terapeutico,
adeguata consulenza genetica.
-nell'ambito dello screening neonatale per la
malattia
Lo
screening neonatale per fibrosi cistica (eseguito in funzione della legge
23/12/93 n.548: Disposizioni per la prevenzione e la cura della fibrosi
cistica) viene abitualmente realizzato attraverso un primo accertamento
biochimico: il dosaggio del tripsinogeno immunoreattivo (IRT).
I
casi IRT positivi sono una esigua minoranza (0.5-1%) della popolazione totale
screenata attraverso il test biochimico
e rappresentano una fascia di popolazione a più alto rischio di fibrosi
cistica. L'IRT risulta elevato, nei primi mesi di vita, negli affetti da
fibrosi cistica, ma anche in alcuni neonati sani (71); al fine di migliorare la
specificità dello screening alcuni programmi prevedono che i neonati con IRT
elevato siano sottoposti ad analisi delle più frequenti mutazioni. Per fare ciò
viene utilizzato lo stesso campione di sangue, raccolto alla nascita, su cui è
stata dosato l'IRT. La presenza di due mutazioni consente di porre diagnosi di
malattia, mentre qualora se ne individui una sola il test del sudore
discriminerà tra semplici portatori e malati con una sola mutazione identificabile. Nei casi in cui non si
riscontrino mutazioni le famiglie dei neonati non vengono allertate, migliorando in tal modo la specificità del
sistema e riducendo il numero dei falsi allarmi.
Va
detto che l'analisi genetica nell'ambito dello screening neonatale porta
inevitabilmente all'identificazione di alcuni portatori, riproponendo quindi la
problematica relativa all'individuazione di portatori nella popolazione
generale e inoltre introducendo quella dell'applicazione del test in soggetti
non consapevoli. Esiste consenso sul fatto che analisi genetiche nei minori
sono da sconsigliarsi, tranne alcune
specifiche eccezioni: tra queste l'utilizzo del test genetico per individuare
una patologia per la quale si possa con vantaggio offrire un intervento medico
adeguato e tempestivo (11,72). E' importante una adeguata informazione rivolta
ai genitori dei nuovi nati, in modo che questi siano consapevoli della
possibilità dell'esecuzione di un test genetico in una esigua minoranza di
neonati. Il protocollo di screening neonatale deve inoltre prevedere la
possibilità di rifiuto dell'eventuale approfondimento con studio di mutazioni,
e l'offerta di consulenza genetica alle famiglie di portatori individuati .
Allegati:
Informazioni e
consenso al test genetico FC
Informzioni e
consenso alla diagnosi prenatale FC
Gli autori ringraziano per l'opera di revisione critica:
Paolo Benciolini
,Istituto di Medicina Legale, Università di Padova
Antonio Cao, Clinica Pediatrica, Università di
Cagliari
Giuseppe Novelli,
Istituto di Genetica Medica, Università di Tor Vergata-Roma
Gianni Tognoni, Istituto Mario Negri-Milano
1) Statement of the National Institute of Health
Workshop on population screening for the cystic fibrosis gene. N Engl J Med 1990, 323, 70-71.
2) Statement of the American Society of Human
Genetics on cystic fibrosis carrier screening. Am J Hum Genet 1992, 51, 1443-1444.
3) NIH Consensus Statement. Genetic testing for
cystic fibrosis. Arch Intern Med
1999,159, 1529-1539.
4) Welsh MJ, Smith AE. Molecular Mechanism of CFTR chloride channel dysfunction in
cystic fibrosis.
Cell 1993,73, 1251-1254.
5) Rommens JM, Ianuzzi MC, Kerem BS, Drumm ML,
Melmer G, Dean M, Rozmahel R, Cole JL, Kennedy D, Hidaka N, Zsiga M, Bukwald M,
Riordan JR, Tsui LC, Collin FS. Identification of the cystic fibrosis gene:
Chromosome walking and jumping. Science 1989, 245, 1059-1065.
6) Riordan JR, Rommens JM, Kerem BS, Alon N,
Rozmahel R, Grzelczak Z, Zielenski J, Lok S, Plavsic N. Chou JL, Drumm ML,
Ianuzzi MC, Collins FS, Tsui LC. Identification of the cystic fibrosis gene:
Cloning and characterization of complementary DNA . Science 1989, 245,
1066-1073.
7)Anguiano A, Oates RD, Amos JA, Dean M, Gerrard
B, Stewart C, White T, Milunsky A. Congenital absence of the vas deferens. A
primarily genital form of cystic fibrosis.
JAMA 1992 ,267,1704-1797.
8) Oates RD, Amos JA. The
genetic basis of congenital bilateral absence of the vas deferens and cystic
fibrosis. J. Androl.1994, 15, 1-9.
9) Lissens W, Mercier B, Tournaye H, Bonduelle
M, Ferec C, Seneca S, Deveroey P, Silber S, Van Steirteghem A, Liebaers I. Cystic fibrosis and infertility caused by
congenital bilateral absence of the vas deferens and related clinical entities.
Hum Reprod 1996, 11, suppl 4, 55-78.
10) Cohn J A, Friedman K J, Noone PG, Knowles
MR, Silverman LM, Jowell PS. Relation between mutations of the cystic fibrosis
gene and idiopathic pancreatitis. N Engl J Med 1998, 339, 635-8.
11) Farrel PM,
Kosorok MR, Laxova A, Shen G, Koscik RE, Bruns WT, Spaingard M, Mischler
EH. Nutritional benefits of neonatal screening for cystic fibrosis. N Engl J
Med 1997, 337, 963-9.
12) Frederiksen B, Lanng S, Kock C, Hoiby N.
Improved survival in the danish center-treated cystic fibrosis patients:
results of aggressive treatment. Pediatr Pulmonol 1996,21,153-158.
13) Smith JJ, Travis SM, Greenberg EP, Welsh MJ.
Cystic fibrosis airway epithelia fail to kill bacteria because of abnormal
airway surface fluid. Cell 1996, 85, 231-6.
14) Blank U, Class W,Weber WM.Effects of
benzamil in human cystic fibrosis airway epithelium. Cell Physiol Biochem 1995,
5, 385-390.
15) Visca A, Bignamini E. Concentration of
inhaled amiloride in cystic fibrosis.Lancet 1996, 347, 1126.
16) Yankaskas JR, Mallory GB and the Consensus
Committee. Lung trasplantation in cystic fibrosis. Chest 1998, 113, 217-226.
17) Rosenfeld MA, Collins FS. Gene therapy for
cystic fibrosis . Chest 1996, 109, 241-52.
18) Bossi A, Battistini F, Braggion C,
Celia Magno E, Cosimi A, De Candussio G, Gagliardini R, Giglio L, Giunta A,
Grzincich GL, La Rosa M, Lombardo M,
Lucidi V, Manca A, Mastella G, Moretti P, Padoan R, Pardo F, Quattrucci S, Raia
V, Romano L, Salvatore D, Taccetti G, Zanda M. Registro Italiano Fibrosi
Cistica: 10 anni di attività. Epid Prev 1999, 23,
5-16.
19)
Dodge JA, Morison S, Lewis PA, Coles EC, Geddes D, Russel G, Littlewood
JM, Scott MT. Incidence, population and survival of cystic fibrosis in the U K.
1968-95. Arch Dis Child 1997, 77, 493-96.
20) Romeo G, Bianco M, Devoto M,
Menozzi P, Mastella G, Giunta AM, Micalizzi C, Antonelli M, Battistini A,
Santamaria F, Castello D, Marianelli A, Marchi AG, Manca A, Miano A. Incidence
in Italy, genetic heterogeneity and segregation analysis of cystic fibrosis. Am J Hum Genet 1985, 37, 338-349.
21) Castellani C, Bonizzato A, Cabrini G, Mastella G. Newborn screening strategy for
cystic fibrosis: a field study in an area with high allelic heterogeneity. Acta
Paediatr 1997, 86, 497-502.
22) Cystic Fibrosis Genetic Consortium. Cystic
Fibrosis Genetic Data Base. URLP: htpp://www.genet. sickkids.on.ca/cftr.
23) Lucotte G, Hazout S, De Braekkeleer M.
Complete map of cystic fibrosis mutation DF508 frequencies in Western Europe
and correlation between mutation frequencies and incidence of the disease. Hum Biol 1995, 67, 797-803.
24) Rendine S, Calafell F, Cappello N, Gagliardini
R, Caramia G, Rigillo N, Silvetti M, Zanda M, Miano A, Battistini F, Marianelli
M, Taccetti G, Diana MC, Romano L, Romano C, Giunta A, Padoan R, Pianaroli A,
Raia V, De Ritis G, Battistini A, Grzincich G, Iapichino L, Pardo F, Antonelli
M, Quattrucci S, Lucidi V, Castro M, Santini B, Castello M, Guanti G, Leoni GB,
Cao A, Toffoli C, Lucci E, Vullo C, Torricelli F, Sbernini F, Romeo G,
Ronchetto P, Seia M, Rossi A, Ferrari M, Cremonesi L, Salvatore F. Castaldo G,
D'Alcamo E, Maggio A, Sangiuolo F, Dallapiccola B, Maceratesi P, Bisceglia L,
Gasparini P, Carbonara A, Bonizzato A, Cabrini G, Bombieri C, Pignatti PF,
Borgo G, Castellani C, Villani A, Arduino C, Salvatore D, Mastella G, Piazza A.
Genetic history of cystic fibrosis mutations in Italy. I.Regional
distribution.
Ann. Hum. Genet 1997,61,411-424.
25) The Cystic Fibrosis Genotype-Phenotype
Consortium. Correlation between genotype and phenotype in patients with cystic
fibrosis . N Engl J Med 1993,329,1308-13.
26) Borgo G, Gasparini P, Bonizzato A,
Cabrini G, Mastella G, Pignatti PF. Cystic
fibrosis: the DF508 mutation does not
lead to an exceptionally severe phenotype. A cohort study. Eur J Pediatr 1
993,152,1006-1011.
27) Mickle JE, Cutting GR. Genotpe-phenotype
relationships in cystic fibrosis. Med Clin of North Am 2000, 84, 597-607.
28) Rozmahel R, Wilschanski M, Matin A, Plyte S,
Oliver M, Auerbach W, Moore A, Forstiver J, Durie P, Nadea J, Bear C, Tsui LC.
Modulation of disease severity of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
deficient mice by a secondary genetic factor.
Nat Genet 1996, 12, 280-287.
29) Santis G, Osborne L, Knight RA, Hodson ME.
Independent genetic determinants of pancreatic and pulmonary status in cystic
fibrosis. Lancet 1990, 336,
1081-1084.
30) Borgo G, Mastella G, Gasparini P,
Zorzanello A; Doro R, Pignatti PF. Pancreatic
function and gene deletion DF508. J Med Genet 1990, 27, 665-669.
31) Pignatti PF, Bombieri C, Marigo C, Benetazzo
MG, Luisetti M. Increased incidence of cystic fibrosis gene mutations in adults with disseminated
bronchiectasis. Hum Mol Genet 1995,
4, 635-639.
32) Bonizzato A, Rolfini R, Cabrini G, Detection
of cystic fibrosis mutations by reverse dot-blot hybridization. Eur J Lab Med
1999,7,117-122.
33) Wall J, Cai S, Chehab FF. A 31-mutation
assay for cystic fibrosis testing in the clinical molecular diagnostic
laboratory. Hum Mutat 1995,5, 333-338.
34) Gasparini P, Arbustini E, Restagno G,
Zelante L, Stanziale P, Gatta L, Sbaiz L, Sedita AM, Banchieri N, Sapone L, Fiorucci GC, Brinson E, Shulse
E, Rappaport E, Fortina P. Analysis of 31 CFTR mutations by polymerase chain
reaction /oligonucleotide ligation assay in a pilot screening of 4476 newborns
for cystic fibrosis. J Med Screen 1999, 6, 67-69.
35) Wu Y, Hofstra RMW , Sheffer H, Uiterlinden
A, Mullaart E, Buys CHCM, Vijg J. Comprehensive and accurate mutation scanning
of the CFTR gene by two dimensional DNA electrophoresis. Hum Mutat 1996,8,
160-167.
36 ) King's Fund Forum. Consensus Statement:
screening for fetal and genetic abnormality. Br Med J 1987, 295, 1551-1553.
37) Lemna WK, Gerald M S, Feldman L, Kerem B,
Fernbach SD, Zevkovich EP, O'Brien WE, Riordan JR, Collins FS, Tsui LC,
Beaudet AL. Mutation analysis for
heterozygote detection and the prenatal diagnosis of cystic fibrosis. N Engl J
Med 1990, 322, 291-296.
38) Surh
LC, Cappelli M, MacDonald NE, Mettler G, Dales R. Cystic fibrosis carrier
screening in a high risk population. Participation based on a traditional
recruitment process. Arch Pediatr Adolesc Med 1994, 148 632-637.
39) Borgo G, Castellani C, Bonizzato A,
Rolfini R, Altieri S, Zanolla L, Mastella G. Carrier testing program in a high
risk cystic fibrosis population from Northeastern Italy. Active recuitment of
relatives via proband's parents. Community Genet 1999, 2, 82-90.
40) Tambor ES, Bernhardt BA, Chase GA, Faden RR,
Geller G, Hofman KJ, Holtzman NA. Offering cystic fibrosis carrier screening to
an HMO population: factors associated with utilization. Am J Hum Genet 1994, 55, 626-637.
41) Bekker H, Modell M, Denniss G, Silver A,
Mathew C, Bobrow M, Marteau T. Uptake of cystic fibrosis testing in primary
care: Supply push or demand pull? BMJ
1993, 306, 1584-1586.
42) Brock DJ. Heterozygote
screening for cystic fibrosis. Eur
J Hum Genet 1995, 3, 2-13.
43) Witt DR, Schaefer C,
Hallam P, Wi S, Blumberg B, Fishbach A, Holtzman J, Kornfeld S, Lee R, Nemzer
L, Palmer R. Cystic fibrosis heterozygote screening in 5161 pregnant women. Am
J Hum Genet 1996, 58, 823-835.
44) Clayton EW, Hannig VL, Pfotenhauer JP, Parker RA, Campbell PW
3rd, Phillips JA 3rd. Lack of interest by
non pregnant couples in population-based
cystic fibrosis carrier screening. Am J Hum Genet 1996, 58, 617-627.
45) Langfelder Schwind E, Wolfe M, Greendale K,
Misra LM, Pass KA, Wallerstein R. Cystic fibrosis carrier screening practices
in an ethnically diverse region: experience of the Genetic Network of the
Empire State, Puerto Rico and the U.S. Virgin Islands. Genetic Testing 1999,3, 215-218.
46)
Bonizzato A, Bisceglia L, Marigo M, Nicolis E, Bombieri C, Castellani C,
Borgo G, Zelante L, Mastella G; Cabrini G, Gasparini P, Pignatti PF. Analysis of the
complete coding region of the CFTR gene in a cohort of CF patients from
Northeastern Italy: identification of 90% of the mutations. Hum Genet 1995, 95,397-402.
47) Hillman AL, Schwartz
JS, Pauly MV, Bloom BS, Eisenberg JM, Willian MK. Economic
analysis of health care technology - a report on principles. Ann Intern Med 1995, 123, 61-70.
48) Lieu TA, Watson SE,
Washington AE. The cost-effectiveness of prenatal
screening programme for cystic fibrosis: Obstr-Gynecolog 1994, 84, 903-912.
49) Ginsberg G, Blau H, Kerem E, Springer C,
Kerem BS, Akstein E, Greenberg A, Kolumbos A, Abeliovich D, Gazit E, Yahav J.
Cost-benefit analysis of a national screening programme for cystic fibrosis in
an Israeli population. Health Economics 1994, 3,5-23.
50) Wildhagen MF, Hilderink HBM, Verzijl JG,
Verheij JBGM, Kooij L,Tijmstra T, Ten Kate LP, Habbema JDF. Costs, effects and savings
of screening for cystic fibrosis gene carriers. J Epidemiol Community Health
1998, 52, 459-467.
51) VerheijJBGM, Wildhagen
MF, Hofstra RMW. Pals G, Habbema JDF, ten Kate
L.Preconceptional screening of couples for carriers of cystic fibrosis: a prospective
evaluation of effects,costs and savings for different mutation detection
methods. Community genet
1999,2,74-81.
52) Novelli G, Pignatti PF, Migone N,
Ballabio A, Ferrari M, Spagnolo A, Forabosco A, Mazzotti G, Dalla piccola B.
Test diagnostici di genetica molecolare.Notiziario dell'Istituto Superiore di
Sanità 1996, 9,1-4.
53) Dequeker E, Cassiman JJ.Evaluation of CFTR
gene mutation testing methods in 136 diagnostic laboratories: report of a large
European external quality assessment. Eur J Hum Genet 1998,6, 165-175.
54) Muller F, Dommergues M,
Simon-Bouy B, Ferec C, Oury JF, Aubry MC, Bessis R, Vuillard E, Denamur E,
Bienvenu T, Serre JL. Cystic fibrosis
screening : a fetus with hyperechogenic bowel may be the index case. J Med
Genet 1998,35,657-660.
55)Monagan KG,Feldman GL. The
risk of cystic fibrosis with prenatally detected echogenic bowel in an
ethnically and raciallly diverse North American population.
Prenat Diagn 1999,19,604-609.
56) Slotnick RN, Abuhamad AZ.Prognostic
implications of fetal echogenic bowel. Lancet 1996, 347, 85-87.
57) Stringer MD, Thornton JM, Mason GC.
Hperechogenic fetal bowel. Arch Dis Child 1996,74, F1-F2.
58) Traystman MD, Schulte NA, MacDonald M,
Anderson JR,Sanger WG.Mutation analysis for cystic fibrosis to determine
carrier status in 167 sperm donors from the Nebraska Genetic Semen Bank.Hum Mut
1994,4, 271-275.
59) Findlay I, Cuckle H, Lilford RJ, Rutheford
AJ, Quirke PH,Lui S.Screening sperm donors for cystic fibrosis. BMJ 1995,
310,16.
60) Bick D, Fugger EF, Pool SH, Brent Hazelrigg
W, Yadvish KN, Spence WC, Maddalena A, Howard-Peebles PN, Schulman JD.
Screening semen donors for hereditary diseases. J Reprod Med 1998,43,423-428.
61) Pradal U, Castellani C, Delmarco A, Mastella
G.Nasal potential difference in congenital bilateral absence of the vas
deferens.Am J Resp Crit Care Med 1998 , 158,896-901.
62) Dallapiccola B. Bollettino SIGU
marzo1999, pag 7.http:// sigu.uniroma 2.it.
63) Van der Ven K, Messer L, Van der Ven, H,
Jeyendran RS, Ober C. Cystic fibrosis mutation screening in healthy men with
reduced sperm quality. Hum Reprod 1996,
11, 513-517.
64) Meschede D, Dworniczak B, Behre HM, Kliesch
S, Claustres M, Nieschlag E, Horst J. CFTR gene mutations in men with bilateral
ejaculatory-duct obstruction and anomalies of the seminal vesicles. Am J Hum Genet 1997, 61,1200-1202.
65) Ao A, Handyside A, Winston RML.
Preimplantation genetic diagnosis of cystic fibrosis. Eur J Obstet Gynecol
Reprod Biol 1996, 65, 7-10.
66) Lissens W, Sermon K. Preimplantation genetic
diagnosis: current status and new developments. Hum Reprod 1997, 12, 1756-1761.
67) Brock DJH,Clarke HAK, Barron L. Prenatal
diagnosis of cystic fibrosis microvillar enzyme assay on a sequence of 258
pregnancies . Hum Genet 1988,78,271-275.
68) Canciani M, Boldrin F, Forno
S,Olivieri D, Mastella G. Il test del sudore rivisitato: qualità discriminanti
e valori di riferimento (studio retrospettivo su 2433 soggetti). Riv Ital Ped
1986, 12, 254-261.
69) Stewart B, Zabner J, Shuber AP, Welsh MJ,
McCray PB .Normal sweat chloride values do not exclude the diagnosis of cystic
fibrosis. Am J Crit Care Med 1995,151, 899-903.
70) Delmarco A, Pradal U, Cabrini G, Bonizzato
A, Mastella G. Nasal potential difference in cystic fibrosis patients
presenting borderline sweat test. Eur
Respir J 1997,10, 1145-1149.
71) Ranieri E, Ryall RG,
Lewis BD, Gerace RL, Morris CP, Nelson PV, Carey WF, Pollard AC, Robertson EF. Neonatal
screening for cystic fibrosis using immunoreactive trypsinogen and direct gene
analysis. BMJ 1991, 302,1237-1240.
72) Masciovecchio MV, Gabbarini J,Vega M,
Drirtariti L.The interactivity betweeen the CFTR gene and cystic fibrosis would
be limited to the initial phase of the disease.Gen in Med 2000,2,124-130.