Consiste in un complesso insieme di tecniche di manipolazione del DNA che consentono di isolare dei brevi segmenti di tale molecola, per moltiplicarli, studiarne la sequenza nucleotidica, trasferirli nel genoma di altre cellule controllandone l’incorporazione e l’espressione.

• Avere segmenti abbastanza piccoli da essere analizzati e manipolati
• Avere grosse quantità di questi piccoli segmenti
• Conoscere la sequenza nucleotidica di questi segmenti
• Essere in grado d’identificare i segmenti specifici presi in considerazione

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Nei batteri sono presenti degli enzimi, detti enzimi di restrizione, che tagliano le molecole estranee di DNA in piccoli segmenti, prima che vengano duplicati o trascritti. Il taglio è effettuato presso sequenze nucleotidiche specifiche, dette di riconoscimento. I batteri producono questi enzimi, per proteggersi dall’aggressione dei virus batteriofagi.

Esistono due tipi di enzimi:

1. alcuni tagliano di netto la molecola di DNA
2. altri tagliano la molecola di DNA con lo scarto di alcuni nucleotidi, detti estremità coesive ( o “appiccicose”). Queste possono unirsi ad un’altra molecola di DNA (con estremità coesiva complementare) tagliata dallo stesso enzima di restrizione, mediante l’enzima DNA-ligasi.

Brevi segmenti di DNA si possono ottenere in due modi:

1. attraverso gli enzimi di restrizione;
2. attraverso l’enzima trascrittasi inversa (catalizza la trascrizione dell’mRNA in DNA). Dopo che è avvenuta la sintesi di un filamento singolo di DNA, il filamento di RNA messaggero viene eliminato. Infine si assembla il secondo filamento di DNA, usando il primo come stampo.
3. Se invece è nota la sequenza di DNA, si possono sintetizzare segmenti di esso in laboratorio mediante mezzi chimici.

Per avere un numero elevato di segmenti di DNA identici si possono utilizzare due tipi di tecniche:

Clonazione del DNA

I dispositivi per duplicare i brevi segmenti di DNA sono i batteri; il più utilizzato tra questi è E. Coli poiché le conoscenze su di lui sono molto più specifiche, che su qualunque altro essere vivente.
Ciò di cui si ha bisogno sono dei vettori (plasmidi e virus), che possano trasportare i segmenti di DNA da moltiplicare nelle cellule batteriche.
Si opera in questo modo:

1. si isola il DNA che si vuole prendere in esame e un plasmide;
2. si tagliano entrambi con lo stesso enzima di restrizione che crea estremità coesive sia nel DNA che nel plasmide;
3. il segmento di DNA è mescolato con il plasmide tagliato. Le basi azotate delle estremità coesive del plasmide si appaiano con quelle delle estremità complementari del frammento di DNA in analisi;
4. l’enzima DNA-ligasi unisce mediante legami covalenti le due molecole di DNA.
Questo plasmide è inserito in un batterio, dove assieme al DNA estraneo, che esso porta con se, inizia a duplicarsi, producendo quantità enormi di copie. Tali copie multiple sono dette cloni.
Questo metodo ha il vantaggio di produrre grandi quantità di sostanze in poco tempo.

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

Questo processo è stato messo a punto nel 1989 ed è in grado a partire da un piccolissimo campione di DNA, in poche ore, di sintetizzare milioni di copie di uno specifico segmento di DNA. Pertanto risulta più rapido rispetto alla clonazione del DNA e differentemente da questa necessita della conoscenza delle sequenze nucleotidiche di ciascuna estremità del segmento di DNA che si vuole copiare.
In campo medico questa tecnica è usata per la diagnosi prenatale delle malattie genetiche e per la ricerca d’infezioni causate da virus latenti (AIDS).

Il processo si svolge in questo modo:

1. Il campione di DNA è posto in una soluzione contenente molecole di DNA-polimerasi (enzimi usati per la duplicazione del DNA) ed un numero sufficiente di nucleotidi (molecole “innesco” di DNA).
2. Nella miscela il DNA si duplica dando luogo a due nuovi filamenti identici; queste molecole, a loro volta, si duplicano e il processo continua finché si trovano nucleotidi a disposizione.

Ad ogni duplicazione la quantità di DNA raddoppia.

I sistemi di sequenziazione del DNA:

• elettroforesi
• reazioni chimiche o enzimatiche

Campioni identici di una molecola di DNA da sequenziare vengono trattati con differenti enzimi di restrizione che tagliano il DNA in siti differenti. I frammenti di ciascun gruppo sono separati tra loro, clonati ed analizzati. In questo modo si determinano le sequenze nucleotidiche di ciascun frammento.
I frammenti prodotti dai due enzimi di restrizione si sovrappongono ed è possibile determinare la sequenza nucleotidica dell’intera molecola.

Ibridazione
L’ibridazione rappresenta uno dei metodi per individuare ed isolare i segmenti specifici di DNA e si basa sulla proprietà di appaiarsi tipica delle basi azotate degli acidi nucleici.

Processo di ibridazione:

1. si mescolano molecole di DNA di diversa provenienza, in una soluzione;
2. si scalda il tutto provocando la rottura dei legami ad idrogeno, che uniscono i due filamenti;
3. lasciando raffreddare, i ponti ad idrogeno tendono a ristabilirsi e i filamenti possono riappaiarsi con altri filamenti dalla sequenza genetica quasi completamente ;
4. 4. una volta che si sono riformati i ponti a idrogeno abbiamo ottenuto delle doppie eliche ibride.

Sonde
Per individuare i segmenti ibridi specifici si ricorre all’uso di sonde (mRNA, sequenze di DNA o segmenti di DNA sintetici), che cerchino segmenti di DNA o RNA con una sequenza complementare.
Si prende un isotopo radioattivo e lo si inserisce in un breve segmento di DNA o RNA a filamento singolo ,che deve avere la sequenza complementare a quella cercata; la sonda può anche essere marcata con un colorante fluorescente.
Altri marcatori genetici sono i RFLP: la loro esistenza è dovuta al fatto che variazioni ereditarie, o mutazioni, portano a lunghezze differenti dei frammenti prodotti dagli enzimi di restrizione.