Figlio di ebrei russi immigrati in America, Wilder ha dato inizio ai suoi studi di recitazione ed a lavorare negli spettacoli estivi di una compagnia di repertorio mentre ancora frequentava l’Università dell’Iowa. Al conseguimento del diploma, Gene si è iscritto alla Bristol Old Vic Theatre School. Rientrato negli Stati Uniti, l'attore è ricorso all'insegnamento della scherma ed a lavori occasionali per mantenersi agli studi. Alla frequentazione dei teatri off-Broadway è seguita, agli inizi degli anni '60, la sua entrata all'Actor’s Studio e la sua apparizione in vari spettacoli di Broadway.

  Sposatosi il 27 ottobre 1967 con Mary Joan Schutz (ma da cui ha divorziato nel 1974), la carriera di Wilder è cominciata con il ruolo di vittima di un rapimento nel film "Gangster Story" dello stesso anno, di Arthur Penn e con Warren Beatty (Clyde Barrow) e Faye Dunaway (Bonnie Parker), per poi guadagnare una nomination all'Oscar con "Per favore non toccate le vecchiette" di Mel Brooks nel 1968. Il talento di Gene ha sempre trovato sbocco nelle commedie e nel genere comico, ma della sua filmografia fa parte anche la pellicola seria "Il gioco del giovedì". Altra nomination all'Oscar gli venne nel 1974 grazie alla sceneggiatura di "Frankenstein Junior". Si ritiene che la sua migliore interpretazione sia quella di "La signora in rosso" nel 1984.
  Al 1984 risale il matrimonio di Wilder con Gilda Radner, anch'essa attrice, incontrata sul set di "Hanky Panky - Fuga per due" (1982). La prematura scomparsa della moglie nel 1989 per una grave malattia ha segnato profondamente l'attore.
  Le ultime realizzazioni di Wilder sono "Funny About Love", una commedia diretta nel 1990 da Leonard Nimoy, e la sitcom televisiva "Something Wilder", andata in onda nel 1994 e nel 1995.
  L'8 settembre 1991 ha sposato Karen Boyer.